Спеціальні види мікроскопії
Чортків. Використовують спеціальний конденсор, що виділяє структурні структури незабарвленого матеріалу. Темнопільна мікроскопія дозволяє спостерігати живі об'єкти. Об'єкт, що спостерігається, виглядає як освітлений на темному полі. При цьому промені від освітлювача падають на об'єкт збоку, а в лінзи мікроскопа надходять лише розсіяні промені.
Фазово-контрастна мікроскопія дозволяє вивчати живі та незабарвлені об'єкти. При проходженні світла через пофарбовані об'єкти змінюється амплітуда світлової хвилі, а при проходженні світла через незабарвлені – фаза світлової хвилі, що використовують для отримання висококонтрастного зображення у фазово-контрастній та інтерференційній мікроскопії.
Поляризаційна мікроскопія - формування зображення незабарвлених анізотропних структур (наприклад, колагенові волокна та міофібрили).
Інтерференційна мікроскопія поєднує принципи фазово-контрастної та поляризаційної мікроскопії та застосовується для отримання контрастного зображення незабарвлених об'єктів.
Люмінесцентна мікроскопія застосовується для спостереження флюоресціюючих (люмінесцентних) об'єктів. У люмінесцентному мікроскопі світло від потужного джерела проходить через два фільтри. Один фільтр затримує світло перед зразком та пропускає світло довжини хвилі, що збуджує флюоресценцію зразка. Інший фільтр пропускає світло довжини хвилі, що випромінюється флуоресціюючим об'єктом. Таким чином, флюоресціюючі об'єкти поглинають світло однієї довжини хвилі і випромінюють в іншій області спектра.
Флюоресцентні барвники (флюоресцин, родамін та ін.) вибірково зв'язуються зі специфічними макромолекулами.
Електронна мікроскопія
Теоретичний дозвіл ЕМ, що просвічує, становить 0,002 нм. Реальна роздільна здатність сучасних мікроскопів наближається до 0,1 нм. Для біологічних об'єктів дозвіл ЕМ практично становить 2 нм.
ЕМ, що просвічує складається з колони, якою у вакуумі проходять електрони, випромінювані катодної ниткою. Пучок електронів, що фокусується кільцевими магнітами, проходить через підготовлений зразок. Характер розсіювання електронів залежить від густини зразка. Електрони, що проходять через зразок, фокусують, спостерігають на флюоресцентному екрані і реєструють за допомогою фотопластинки.
Скануючий ЕМ застосовують для отримання тривимірного зображення поверхні об'єкта, що досліджується.
Метод сколів ( заморожування-сколювання) застосовують для вивчення внутрішньої будови клітинних мембран. Клітини заморожують при температурі рідкого азоту у присутності кріопротектора та використовують для виготовлення сколів. Площини сколу проходять через гідрофобну середину подвійного шару ліпідів. Голу внутрішню поверхню мембран відтіняють платиною, отримані репліки вивчають у електронному мікроскопі, що сканує.
2.Основні частини світлового мікроскопа їх призначення та пристрій
Роздільна здатність мікроскопа дає роздільне зображення двох близьких один одному ліній. Неозброєне людське око має роздільну здатність близько 1/10 мм або 100 мкм. Кращий світловий мікроскоп приблизно в 500 разів покращує можливість людського ока, тобто його роздільна здатність становить близько 0,2 мкм або 200 нм.
Роздільна здатність і збільшення не одне й теж. Якщо за допомогою світлового мікроскопа отримати фотографії двох ліній, розташованих на відстані менше 0,2 мкм, то як би не збільшувати зображення, лінії будуть зливатись в одну. Можна отримати велике збільшення, але не покращити його дозвіл.
Розрізняють корисне та марне збільшення. Під корисним розуміють таке збільшення об'єкта, що спостерігається, при якому можна виявити нові деталі його будови. Некорисне - це збільшення, у якому, збільшуючи об'єкт у сотні і більше разів, не можна виявити нових деталей будівлі. Наприклад, якщо зображення, отримане за допомогою мікроскопа (корисне!), збільшити ще багато разів, спроектувавши його на екран, то нові, більш тонкі деталі будівлі при цьому не виявляться, а відповідно збільшаться розміри наявних структур.
У навчальних лабораторіях зазвичай використовують світлові мікроскопи, у яких мікропрепарати розглядаються з використанням природного чи штучного світла. Найбільш поширені світлові біологічні мікроскопи: БІОЛАМ, МІКМЕД, МБР (мікроскоп біологічний робітник), МБІ (мікроскоп біологічний дослідний) та МБС (мікроскоп біологічний стереоскопічний). Вони дають збільшення у межах від 56 до 1350 разів. Стереомікроскоп (МБС) забезпечує справді об'ємне сприйняття мікрооб'єкта та збільшує від 3,5 до 88 разів.
У мікроскопі виділяють дві системи: оптичну та механічну До оптичної системи відносять об'єктиви, окуляри та освітлювальний пристрій (конденсор з діафрагмою та світлофільтром, дзеркало або електроосвітлювач).
Механічна частина мікроскопа.
основа (штатив) або масивна ніжка (1);
коробка з мікромеханізмом (2) та мікровинтом (3);
податковий механізм для грубого наведення – макрогвинт або кремальєра (8);
предметний столик (4);
гвинти (5, 6, 12, 13);
голівка (9); револьвер (10); клеми; тубус (11);
дуга або тубусодержатель(7);
Кремальєра (макровінт) – служить для приблизної «грубою» установки на фо-
Механічна система мікроскопа складається з підставки, коробки з мікрометренним механізмом та мікрометрним гвинтом, тубуса, тубусодержателя, гвинта грубого наведення, кронштейна конденсора, гвинта переміщення конденсора, револьвера, предметного столика.
Підставка- це основа мікроскопа.
Коробка з мікрометрним механізмомм, побудованому на принципі шестерен, що взаємодіють, прикріплена до підставки нерухомо. Мікрометренний гвинт служить для незначного переміщення тубусодержателя, а отже, і об'єктива на відстані, що вимірюються мікрометрами. Повний оборот мікрометренного гвинта пересуває тубусоутримувач на 100 мкм, а поворот на один поділ опускає або піднімає тубусоутримувач на 2 мкм. Щоб уникнути псування мікрометрного механізму, дозволяється крутити мікрометренний гвинт в один бік не більше ніж на половину обороту.
Тубус або трубка – циліндр, який зверху вставляють очки. Тубус рухомо з'єднаний з головкою тубусодержателя, його фіксують гвинтом у певному положенні. Послабивши стопорний гвинт, можна зняти тубус.
Револьверпризначений для швидкої зміни об'єктивів, які загвинчуються у його гнізда. Центроване положення об'єктива забезпечує засувка, розташована всередині револьвера.
Гвинт грубоїнаведення використовують для значного переміщення тубусодержателя, а, отже, і об'єктива з метою фокусування об'єкта при малому збільшенні.
Предметний столик призначенийдля розташування на ньому препарату. Всередині столика є круглий отвір, в який входить фронтальна лінза конденсора. На столику є дві пружні клеми - затискачі, що закріплюють препарат.
Кронштейн конденсорарухомо приєднаний до коробки мікрометрного механізму. Його можна підняти або опустити за допомогою гвинта, що обертає зубчасте колесо, що входить у пази рейки з гребінчастою нарізкою.
Мікроскоп(Від грец. mikros- малий та skopeo- дивлюсь) - оптичний прилад для отримання збільшеного зображення дрібних об'єктів та їх деталей, невидимих неозброєним оком.
Перший із відомих мікроскопів був створений у 1590 році в Нідерландах спадковими оптиками. Захаріємі Хансом Янсенамі , що змонтували дві опуклі лінзи всередині однієї трубки. Пізніше Декарт у своїй книзі "Діоптрика" (1637) описав більш складний мікроскоп, складений з двох лінз - плоско-увігнутою (окуляр) і двоопуклою (об'єктив). Подальше вдосконалення оптики дозволило Антоні ван Левенгуку в 1674 виготовити лінзи зі збільшенням, достатнім для проведення простих наукових спостережень і вперше в 1683 описати мікроорганізми.
Сучасний мікроскоп (малюнок 1) складається з трьох основних частин: оптичної, освітлювальної та механічної.
Основними деталями оптичної частини У мікроскопі є дві системи збільшувальних лінз: звернений до ока дослідника окуляр і звернений до препарату об'єктив. Окуляри мають дві лінзи, верхня з яких називається головною, а нижня збірною. На оправі окулярів позначають вироблене ними збільшення(×5, ×7, ×10, ×15). Кількість окулярів у мікроскопа може бути різною, у зв'язку з чим розрізняють монокулярні і бінокулярні мікроскопи (призначені для спостереження за об'єктом одним або двома очима), а також тринокуляри , що дозволяють підключати до мікроскопа системи документування (фото- та відеокамери).
Об'єктиви являють собою систему лінз, укладених у металеву оправу, з яких передня (фронтальна) лінза виробляє збільшення, а корекційні лінзи, що лежать за нею, усувають недоліки оптичного зображення. На оправі об'єктивів цифрами також зазначено ними збільшення (×8, ×10, ×40, ×100). Більшість моделей, призначених для мікробіологічних досліджень, мають у комплекті кілька об'єктивів з різними ступенями збільшення та поворотний механізм, призначений для їхньої швидкої зміни. турель , часто званий « револьверною головкою ».
Освітлювальна частинапризначена для створення світлового потоку, який дозволяє висвітлити об'єкт таким чином, щоб оптична частина мікроскопа точно виконувала свої функції. Освітлювальна частина в прямих мікроскопах світла розташована за об'єктом під об'єктивом і включає в себе джерело світла (лампу та електричний блок живлення) та оптико-механічну систему (конденсор, польову та апертурну регульовану діафрагми). Конденсор складається з системи лінз, які призначені для збирання променів, що йдуть від джерела світла, в одній точці - фокусі , яка повинна знаходитися в площині об'єкта, що розглядається. В свою чергу д іафрагма розташована під конденсором та призначена для регулювання (збільшення або зменшення) потоку променів, що проходять від джерела світла.
Механічна частинамікроскоп містить деталі, що об'єднують описані вище оптичну і освітлювальну частини, а також дозволяють розміщувати і переміщувати досліджуваний препарат. Відповідно, механічна частина складається з підстави мікроскопа та власника , до верхньої частини якого прикріплюються тубус - порожня трубка, призначена для розміщення об'єктива, а також згадана револьверна головка. Нижче знаходиться предметний столик , на який встановлюються предметні стекла з досліджуваними зразками Предметний столик може переміщатися у горизонтальній площині з використанням відповідного пристрою, а також вгору та вниз, що забезпечує налаштування різкості зображення за допомогою грубого (макрометричного) і точного (мікрометричного) гвинтів.
Збільшення,яке дає мікроскоп, визначається добутком збільшення об'єктиву збільшення окуляра. Крім світлопольної мікроскопії широке застосування у спеціальних методах дослідження отримали: темнопольна, фазово-контрастна, люмінесцентна (флюоресцентна) та електронна мікроскопія.
Первинна(Власна) флюоресценція виникає без спеціальної обробки препаратів і властива ряду біологічно активних речовин, таких, як ароматичні амінокислоти, порфірини, хлорофіл, вітаміни А, В2, В1, деякі антибіотики (тетрациклін) та хіміотерапевтичні речовини (акріхін, риванол). Вторинна (наведена) флюоресценція виникає в результаті обробки об'єктів, що мікроскопуються, флюоресцентними барвниками - флюорохромами. Деякі з цих барвників дифузно розподіляються у клітинах, інші вибірково пов'язуються з певними структурами клітин або навіть із певними хімічними речовинами.
Для проведення цього виду мікроскопії використовуються спеціальні люмінесцентні (флюоресцентні) мікроскопи , що відрізняються від звичайного світлового мікроскопа наявністю потужного джерела освітлення (ртутно-кварцова лампа надвисокого тиску або галогенова кварцова лампа розжарювання), що випромінює переважно в довгохвильовій ультрафіолетовій або короткохвильовій (синьо-фіолетовій) області видимого спектру.
Дане джерело використовується для збудження флюоресценції, перш ніж світло проходить через спеціальний збудливий (синьо-фіолетовий) світлофільтр і відбивається інтерференційної світлодільні платівкою , що майже повністю відсікають більш довгохвильове випромінювання і пропускають тільки ту частину спектра, яка збуджує флюоресценцію. При цьому в сучасних моделях люмінесцентних мікроскопів збуджуюче випромінювання потрапляє на препарат через об'єктив (!) Після ж збудження флюоресценції світло, що виникає, знову потрапляє в об'єктив, після чого проходить через розташований перед окуляром замикаючий (жовтий) світлофільтр , що відсікає короткохвильове збуджувальне випромінювання та пропускає світло люмінесценції від препарату до ока спостерігача
В силу використання подібної системи світлофільтрів інтенсивність світіння об'єкта, що спостерігається, зазвичай невелика, у зв'язку з чим люмінесцентну мікроскопію слід проводити в спеціальних затемнених приміщеннях .
Важливою вимогою при виконанні цього виду мікроскопії є також застосування нефлюоресціюючих імерсійних і складових середовищ . Зокрема, для гасіння власної флюоресценції кедрової або іншої іммерсійної олії до неї додають невеликі кількості нітробензолу (від 2 до 10 крапель на 1 г). У свою чергу в якості середовищ для препаратів можуть бути використані буферний розчин гліцерину, а також нефлюоресцентні полімери (полістирол, полівініловий спирт). В іншому при проведенні люмінесцентної мікроскопії застосовують звичайні предметні та покривні стекла, що пропускають випромінювання у використовуваній частині спектру і не мають власної люмінесценції.
Відповідно, важливими перевагами люмінесцентної мікроскопії є:
1) кольорове зображення;
2) високий ступінь контрастності об'єктів, що самосвітяться на чорному тлі;
3) можливість дослідження клітинних структур, що вибірково поглинають різні флуорохроми, які є при цьому специфічними цитохімічними індикаторами;
4) можливість визначення функціонально-морфологічних змін клітин у динаміці їх розвитку;
5) можливість специфічного фарбування мікроорганізмів (з використанням імунофлюоресценції).
Електронна мікроскопія
Теоретичні основи використання електронів для спостереження мікроскопічних об'єктів було закладено У. Гамільтоном , що встановили аналогію між проходженням світлових променів в оптично неоднорідних середовищах та траєкторіями частинок у силових полях, а також де Бройлем , що висунув гіпотезу про існування у електрона одночасно корпускулярних та хвильових властивостей
При цьому, завдяки надзвичайно малій довжині хвилі електронів, яка зменшується в прямій залежності від прискорювальної напруги, що подається, теоретично розрахований межа дозволу , Що характеризує здатність приладу відобразити окремо дрібні, максимально близько розташовані деталі об'єкта, у електронного мікроскопа становить 2-3 Å ( Ангстрем , Де 1Å = 10 -10 м), що у кілька тисяч разів вище, ніж у оптичного мікроскопа. Перше зображення об'єкта, сформоване пучками електронів, було отримано 1931р. німецькими вченими М. Кноллем і Е. Руска .
У конструкціях сучасних електронних мікроскопів джерелом електронів служить метал (зазвичай вольфрам), з якого після нагрівання до 2500 ºС в результаті термоелектронної емісії випромінюються електрони. За допомогою електричних та магнітних полів формується потік електронів можна прискорювати та уповільнювати, а також відхиляти у будь-яких напрямках та фокусувати. Таким чином, роль лінз в електронному мікроскопі відіграє сукупність відповідним чином розрахованих магнітних, електростатичних та комбінованих пристроїв, званих « електронними лінзами» .
Необхідною умовою переміщення електронів у вигляді пучка на велику відстань є також створення на їхньому шляху вакууму , оскільки в цьому випадку середня довжина вільного пробігу електронів між зіткненнями з газовими молекулами значно перевищуватиме відстань, на яку вони повинні переміщатися. Для цього достатньо підтримувати в робочій камері негативний тиск приблизно 10 -4 Па.
За характером дослідження об'єктів електронні мікроскопи поділяють на просвічуючі, відбивні, емісійні, растрові, тіньові і дзеркальні , Серед яких перші два є найчастіше використовуваними.
Оптична схема просвічувального (трансмісійного) електронного мікроскопа повністю еквівалентна відповідній схемі оптичного мікроскопа, у якому світловий промінь замінюється електронним променем, а системи скляних лінз замінюються системами електронних лінз. Відповідно, електронний мікроскоп, що просвічує, складається з наступних основних вузлів: освітлювальної системи, камери об'єкта, фокусуючої системи і блоку реєстрації кінцевого зображення , що складається з фотокамери та флуоресцентного екрану.
Всі ці вузли з'єднані один з одним, утворюючи так звану колону мікроскопа, всередині якої підтримується вакуум. Іншою важливою вимогою, що висувається до досліджуваного об'єкта, є його товщина менш ніж 0,1 мкм. Остаточне ж зображення об'єкта формується після відповідного фокусування пучка електронів, що пройшло крізь нього. фотоплівці або флюоресцентний екран , покритому спеціальною речовиною - люмінофором (аналогічний екрану в кінескопах телевізорів) і перетворює електронне зображення на видиме.
При цьому утворення зображення в електронному мікроскопі, що просвічує, пов'язано головним чином з різним ступенем розсіювання електронів різними ділянками досліджуваного зразка і в меншій мірі з різницею в поглинанні електронів цими ділянками. Контраст посилюють також, застосовуючи « електронні барвники »(чотирьохокис осмію, ураніл та ін.), вибірково зв'язуються з деякими ділянками об'єкта. Влаштовані подібним чином сучасні електронні мікроскопи, що просвічують, забезпечують максимальне корисне збільшення до 400000 разів, що відповідає роздільної здатності в 5,0 Å. Виявлене з використанням електронної мікроскопії, що просвічує, тонка будова бактеріальних клітин називають ультраструктурою .
В відбивний (скануючий) електронний мікроскоп зображення створюється з допомогою електронів, відбитих (розсіяних) поверхневим шаром об'єкта за його опроміненні під малим кутом (приблизно кілька градусів) до поверхні. Відповідно, утворення зображення обумовлено відмінністю розсіювання електронів у різних точках об'єкта в залежності від його поверхневого мікрорельєфу, а сам результат подібної мікроскопії постає у вигляді структури поверхні об'єкта, що спостерігається. Контрастність може бути посилена напиленням поверхню об'єкта частинок металу. Досягнута роздільна здатність мікроскопів такого типу становить близько 100 Å.
Лабораторне заняття з ботаніки №1
Тема: «Будова мікроскопа. Приготування часових препаратів. Будова рослинної клітки. Плазмоліз та деплазмоліз.»
Мета: 1. Вивчити будову мікроскопа (марок – МБР, МБІ, Біолам), призначення його елементів. Засвоїти правила роботи із мікроскопом.
- 2. Засвоїти методику приготування часових препаратів.
- 3. Вивчити структурні основні компоненти рослинної клітки: оболонку, цитоплазму, ядро, пластиди.
- 4. Ознайомитися з явищем плазмолізу та деплазмолізу.
- 5. Навчитися порівнювати між собою клітини різних тканин, знаходити в них однакові та різні риси.
Обладнання: мікроскоп, набір для мікрокопіювання, розчин хлористого натрію або цукрози, розчин йоду в йодистому калії, смужки фільтрувального паперу, гліцерин, метиленовий синій, скибочки кавуна, томата, цибуля з антоціаном. мікроскоп препарат клітина
- 1. Ознайомитись із пристроєм біологічного мікроскопа МБР - 1 або Біолам. Записати призначення основних елементів.
- 2. Ознайомитись із пристроєм стереоскопічних мікроскопів МБС - 1.
- 3. Записати правила роботи з мікроскопом.
- 4. Засвоїти методику виготовлення часових препаратів.
- 5. Виготовити препарат епідерми соковитої луски цибулі та розглянути при малому збільшенні ділянку епідерми, що складається з одного шару клітин із добре помітними ядрами.
- 6. Вивчити будову клітини при великому збільшенні, спочатку у краплі води, потім у розчині йоду в йодистому калії.
- 7. У клітинах луски цибулі викликати плазмоліз, впливаючи розчином хлористого натрію. Потім перевести у стан деплазмолізу. Замалювати.
Загальні зауваження
Біологічний мікроскоп – це прилад, за допомогою якого можна розглянути різні клітини та тканини рослинного організму. Пристрій цього приладу досить простий, проте невміле користування мікроскопом призводить до його псування. Саме тому необхідно засвоїти будову мікроскопа, основні правила роботи з ним. У мікроскопі будь-якої марки виділяють такі частини: оптичну, освітлювальну та механічну. До оптичної частини відносять: об'єктиви та окуляри.
Об'єктиви служать збільшення зображення об'єкта і складаються із системи лінз. Ступінь збільшення об'єктива знаходяться у прямій залежності від числа лінз. Об'єктив із великим збільшенням має 8 – 10 лінз. Першу лінзу, звернену до препарату, називають фронтальною. Мікроскоп МБР-1 забезпечений трьома об'єктивами. Збільшення об'єктива позначено у ньому цифрами: 8х, 40х, 90х. Розрізняють робочий стан об'єктива, тобто відстань від покривного скла до фронтальної лінзи. Робоча відстань при об'єктиві 8х дорівнює 13,8 мм, при об'єктиві 40х – 0,6 мм, при об'єктиві 90х – 0,12 мм. Необхідно дуже акуратно та дбайливо поводитися з об'єктивами більшого збільшення, щоб у жодному разі не пошкодити фронтальну лінзу. За допомогою об'єктива в тубусі отримують збільшене, дійсне, але зворотне зображення об'єкта та виявляють деталі його структури. Окуляр служить збільшення зображення, що йде від об'єктива і складається з 2 - 3 лінз, вмонтованих в металевий циліндр. Збільшення окуляра позначено у ньому цифрами 7х, 10х,15х.
Для визначення загального збільшення слід помножити збільшення об'єктиву збільшення окуляра.
Освітлювальний пристрій складається з дзеркала, конденсора з ірисовою діафрагмою та призначений для освітлення об'єкта пучком світла.
Дзеркало служить для збирання та напряму променів світла, що падає від дзеркала на об'єкт. Ірисова діафрагма розташована між дзеркалом та конденсором, складається з тонких металевих пластинок. Діафрагма служить регулювання діаметра світлового потоку, направляемого дзеркалом через конденсор на об'єкт.
Механічна система мікроскопа складається з підставки мікро- та макрогвинтів, тубусоутримувача, револьвера та предметного столика. Мікрометричний гвинт служить для незначного переміщення тубусодержателя, а й об'єктива, на відстані, що вимірюються мікрометрами (мкм). Повний оборот мікрогвинта пересуває тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на один поділ на 2 мкм. Щоб уникнути псування мікрометричного механізму, дозволяється повертати мікрометричний гвинт у бік не більше ніж на половину обороту.
Макровінт використовують для значного переміщення тубусоутримувача. Зазвичай користуються ним під час фокусування об'єкта малому збільшенні. У тубус – циліндр зверху вставляють очки. Револьвер призначений для швидкої зміни об'єктивів, які увінчені в його гнізда. Центроване положення об'єктива забезпечує засувка, розташована всередині револьвера.
Предметний столик призначений розташування на ньому препарату, який фіксується у ньому з допомогою двох замків.
Правила роботи з мікроскопом
- 1. м'якою серветкою протирають оптичну частину мікроскопа.
- 2. ставлять мікроскоп біля краю столу те щоб окуляр перебував проти лівого ока експериментатора і протягом роботи мікроскоп не пересувають. Зошит і всі предмети, необхідні для роботи мають праворуч від мікроскопа.
- 3. повністю відкривають діафрагму. Конденсор ставлять у напівопущене становище.
- 4. за допомогою дзеркала налаштовують сонячний зайчик, дивлячись в отвір предметного столика. Для цього лінза конденсора, що знаходиться під отвором предметного столика, має бути яскраво освітлена.
- 5. переводять мікроскоп при мінімальному збільшенні (8х) в робоче положення - встановлюють об'єктив на відстані 1 см від предметного столика і, дивлячись в окуляр, перевіряють освітленість поля зору. Воно має бути яскраво освітлене.
- 6. на предметний столик поміщають об'єкт, що вивчається, і повільно піднімають тубус мікроскопа до появи чіткого зображення. Переглядають весь препарат.
- 7. вивчення якого - або ділянки об'єкта при великому збільшенні спочатку ставлять цю ділянку у центр зору малого об'єктива. Після цього повертають револьвер так, щоб об'єктив 40х зайняв робоче положення (об'єктив не піднімати!). За допомогою мікроскопа досягають чіткої видимості зображення об'єкта.
- 8. після закінчення роботи переводять револьвер з великого збільшення на мале. Знімають із робочого столика об'єкт, переводять мікроскоп у неробочий стан.
Методика приготування мікропрепарату
- 1. на предметне скло наносять краплю рідини (вода, спирт, гліцерин).
- 2. препарувальною голкою беруть частину об'єкта і поміщають їх у краплю рідини. Іноді роблять зріз органу, що вивчається, за допомогою бритви. Потім, обравши найтонший зріз, кладуть його на предметне скло у краплю рідини.
- 3. закривають об'єкт покривним склом так, щоб під нього не потрапило повітря. Для цього покривне скло беруть двома пальцями за межі, проводять нижню грань до краю краплі рідини та плавно опускають, притримуючи його голкою.
- 4. препарат поміщають на предметний столик та розглядають.
Хід лабораторного заняття
З м'ясистої луски цибулини скальпелем вирізати невеликий шматочок (близько 1 см2). З внутрішнього боку (увігнутого) пінцетом зняти прозору плівку (епідерму). Покласти в приготовлену краплю та накласти покривне скло.
При слабкому збільшенні знайти найбільш освітлене місце (найменше пошкоджене, без складок і бульбашок). Перекласти на сильне збільшення. Розглянути та замалювати одну клітинку. Відзначити оболонку з порами, пісний шар цитоплазми, ядро з ядерцями, вакуолю з клітинним соком. Потім з одного боку покривного скла капають розчин хлористого натрію (плазмолітик). З протилежного боку, не зсуваючи препарат, починають відсмоктувати воду шматочками фільтрувального паперу, при цьому необхідно дивитися в мікроскоп і стежити за тим, що відбувається в клітинах. Виявляють поступове відходження протопласту від оболонки клітини, внаслідок виходу води із клітинного соку. Настає такий момент, коли протопласт усередині клітини відокремлюється від оболонки повністю та приймає повний плазмоліз клітини. Потім змінюють плазмолітик водою. Для цього обережно поміщають краплю води на межу покривного скла з предметними, повільно відмивають препарат від плазмолітика. Спостерігають, що поступово клітинний сік заповнює весь обсяг вакуолі, цитоплазма застосовується оболонки клітини, тобто. настає деплазмоліз.
Слід замалювати клітину в плазмолірованому та деплазмолірованому станах, позначити всі частини клітини: ядро, оболонку, цитоплазму.
За таблицями замалювати схему субмікроскопічної будови рослинної клітини, позначити всі компоненти.
Шкірка цибулі
Цитоплазма ядро оболонка
Шкірка цибулі. Органоїди клітки.
Цитоплазма - це обов'язкова складова частина клітини, у якій відбуваються складні та різноманітні процеси синтезу, дихання, росту.
Ядро – одне з найважливіших органоїдів клітини.
Оболонка - це поверхневий шар, що обтягує що-небудь.
Плазмоліз при додаванні розчину натрій хлор
Плазмоліз – це відставання цитоплазми від клітинної оболонки, що відбувається внаслідок втрати води вакуоллю.
Деплазмоліз
Деплазмоліз - це явище, при якому протопласт повертається у зворотний стан.
Плазмоліз при додаванні цукрози
Деплазмоліз при додаванні цукрози
Висновок: Сьогодні ми ознайомилися з пристроєм біологічного мікроскопа, також засвоїли методику приготування тимчасових препаратів. Ми вивчали основні структурні компоненти рослинної клітини: оболонку, цитоплазму, ядро з прикладу шкірки цибулі. І ознайомилися із явищем плазмолізу та деплазмолізу.
Запитання для самоконтролю
- 1. Які частини клітки можна розглянути в оптичний мікроскоп?
- 2. Субмікроскопічна будова рослинної клітини.
- 3. Які органели становлять субмікроскопічну структуру ядра?
- 4. Яка будова цитоплазматичної мембрани?
- 5. Відмінності рослинної клітини від тварин?
- 6. Як довести проникність клітинної мембрани?
- 7. Значення плазмолізу та деплазмолізу для рослинної клітини?
- 8. Як здійснюється зв'язок між ядром та цитоплазмою?
- 9. Місце вивчення теми "Клітка" в курсі загальної біології середньої школи.
Література
- 1. А.Є. Васильєв та ін. Ботаніка (анатомія та морфологія рослин), «Освіта», М,1978, с.5-9, с.20-35
- 2. Кисельова Н.С. Анатомія та морфологія рослин. М. «Вища школа», 1980, с.3-21
- 3. Кисельова Н.С., Шелухін Н.В. Атлас з анатомії рослин. . «Вища школа», 1976
- 4. Хржановський В.Г. та ін Атлас з анатомії та морфології рослин. "Вища школа", М., 1979, с.19-21
- 5. Воронін Н.С. Керівництво до лабораторних занять з анатомії та морфології рослин. М., 1981, с.27-30
- 6. Тутаюк В.Х. Анатомія та морфологія рослин. М. «Вища школа», 1980, с.3-21
- 7. Д.Т. Конисбаєва ПРАКТИКУМ З АНАТОМІЇ І МОРФОЛОГІЇ РОСЛИН
Функціональні частини мікроскопа
Мікроскоп включає три основні функціональні частини:
1. Освітлювальна частина
Призначена для створення світлового потоку, який дозволяє висвітлити об'єкт таким чином, щоб наступні частини мікроскопа точно виконували свої функції. Освітлювальна частина мікроскопа світла розташована за об'єктом під об'єктивом у прямих мікроскопах і перед об'єктом над об'єктивомв інвертованих. Освітлювальна частина включає джерело світла (лампа та електричний блок живлення) та оптико-механічну систему (колектор, конденсор, польова та апертурна регульовані/ірисові діафрагми).
2. Відтворююча частина
Призначена для відтворення об'єкта в площині зображення з необхідною для дослідження якістю зображення та збільшення (тобто для побудови такого зображення, яке якомога точніше і у всіх деталях відтворювало б об'єкт з відповідною оптикою) мікроскопадозволом, збільшенням, контрастом та кольоропередачею). Відтворювальна частина забезпечує перший ступінь збільшення та розташована після об'єкта до площини зображення мікроскопа.
Відтворююча частина включає об'єктивта проміжну оптичну систему.
Сучасні мікроскопи останнього покоління базуються на оптичних системах об'єктивів, скоригованих на безкінечність. Це вимагає додаткового застосування так званих тубусних систем, які паралельні пучки світла, що виходять з об'єктиву, «збирають» у площині зображення мікроскопа.
3. Візуалізуюча частина
Призначена для отримання реального зображення об'єкта на сітківці ока, фотоплівці або платівці, на екрані телевізійного або комп'ютерного монітора з додатковим збільшенням (другий рівень збільшення).
Візуалізуюча частина розташована між площиною зображення об'єктива та очима спостерігача ( камерою, фотокамерою). Візуалізуюча частина включає монокулярну, бінокулярну або тринокулярну візуальну насадку зі спостережною системною ( окулярами, які працюють як лупа).
Крім того, до цієї частини належать системи додаткового збільшення (системи оптоваря/зміни збільшення); проекційні насадки, у тому числі дискусійні для двох та більше спостерігачів; рисувальні апарати; системи аналізу та документування зображення з відповідними адаптерними (що погоджують) елементами.
Конструктивно-технологічні частини
Сучасний мікроскоп складається з наступних конструктивно-технологічних елементів:
оптичної;
механічною;
електричної.
Механічна частина мікроскопа
Основним конструктивно-механічним блоком мікроскопа є штатив. Штатив включає наступні основні блоки: основаі тубусоутримувач.
підставає блоком, на якому кріпиться весь мікроскоп. У простих мікроскопах на підставу встановлюють дзеркало освітлювальні або накладні освітлювачі. У складніших моделях освітлювальна система вбудована в основу без або з блоком живлення.
Різновиди основ мікроскопа
основа з освітлювальним дзеркалом;
так зване «критичне» чи спрощене висвітлення;
освітлення за Келлером.
вузол зміни об'єктивів, що має наступні варіанти виконання - револьверний пристрій, різьбовий пристрій для вкручування об'єктиву, «салазки» для безрізьбового кріплення об'єктивівза допомогою спеціальних напрямних;
фокусувальний механізм грубого та точного налаштування мікроскопа на різкість - механізм фокусувального переміщення об'єктивів або столиків;
вузол кріплення змінних предметних столиків;
вузол кріплення фокусувального та центрувального переміщення конденсора;
вузол кріплення змінних насадок (візуальних, фотографічних, телевізійних, різних пристроїв).
У мікроскопах можуть використовуватися стійки для кріплення вузлів (наприклад, фокусувальний механізм у стереомікроскопах або кріплення освітлювача деяких моделей інвертованих мікроскопів).
Чисто механічним вузлом мікроскопа є предметний столикпризначений для кріплення або фіксації в певному положенні об'єкта спостереження. Столики бувають нерухомі, координатні і обертові (центровані та нецентровані).
Вивчення клітин мікроорганізмів, невидимих неозброєним оком, можливе лише з допомогою мікроскопів. Ці прилади дозволяють отримувати зображення об'єктів, що досліджуються, збільшене в сотні разів (світлові мікроскопи), в десятки і сотні тисяч разів (електронні мікроскопи).
Біологічний мікроскоп називається світловим, так як він забезпечує можливість вивчати об'єкт у світлі, що проходить, у світлому і темному полі зору.
Основними елементами сучасних світлових мікроскопів є механічна та оптична частини (рис. 1).
До механічної частини належать штатив, тубус, револьверна насадка, коробка мікромеханізму, предметний столик, макрометричні та мікрометричні гвинти.
Штативскладається з двох частин: основи та тубусоутримувача (колонки). підставаМікроскоп прямокутної форми має знизу чотири опорні майданчики, що забезпечує стійке положення мікроскопа на поверхні робочого столу. Тубусоутримувачз'єднується з основою і може переміщатися у вертикальній площині за допомогою макро- та мікрометричних гвинтів. При обертанні гвинтів за годинниковою стрілкою одержується тубусодержатель, при обертанні проти годинникової стрілки - піднімається від препарату. У верхній частині тубусоутримувача укріплена головказ гніздом для монокулярної (або бінокулярної) насадки та напрямної для револьверної насадки. Головка кріпиться гвинтом.
Тубус -це труба мікроскопа, що дозволяє підтримувати певну відстань між основними оптичними деталями – окуляром та об'єктивом. Вгорі тубус вставляється окуляр. Сучасні моделі мікроскопів мають похилий тубус.
Револьверна насадкаявляє собою увігнутий диск з декількома гніздами, в які 3 – 4 об'єктиви. Повертаючи револьверну насадку, можна швидко встановити будь-який об'єктив у робоче положення під отвір тубуса.
Мал. 1. Пристрій мікроскопа:
1 – основа; 2 – тубусоутримувач; 3 – тубус; 4 – окуляр; 5 – револьверна насадка; 6 – об'єктив; 7 – предметний столик; 8 – клеми, що притискають препарат; 9 – конденсор; 10 – кронштейн конденсора; 11 – рукоятка переміщення конденсора; 12 – відкидна лінза; 13 – дзеркало; 14 - макрогвинт; 15 - мікрогвинт; 16 - коробка з механізмом мікрометричного фокусування; 17 – головка для кріплення тубуса та револьверної насадки; 18 - гвинт для кріплення головки
Коробка мікромеханізмунесе з одного боку напрямну для кронштейна конденсора, з другого – напрямну для тубусодержателя. Усередині коробки знаходиться механізм фокусування мікроскопа, що є системою зубчастих коліс.
Предметний столикслужить розміщення у ньому препарату чи іншого об'єкта дослідження. Столик може бути квадратним чи круглим, рухомим чи нерухомим. Рухливий столик переміщається в горизонтальній площині за допомогою двох бічних гвинтів, що дозволяє розглядати препарат у різних полях зору. На нерухомому столику для обстеження об'єкта у різних полях зору препарат переміщують рукою. У центрі предметного столика є отвір для освітлення знизу променями світла, що прямують від освітлювача. На столику є дві пружинні клемипризначені для закріплення препарату.
Деякі системи мікроскопів забезпечені препаратів, необхідним при дослідженні поверхні препарату або при підрахунку клітин. Препарат дозволяє проводити пересування препарату у двох взаємно-перпендикулярних напрямках. На препаратоводителі є система лінійок - ноніусів, за допомогою яких можна присвоїти координати будь-якої точки досліджуваного об'єкта.
Макрометричний гвинт(макровінт) служить для попередньої орієнтовної установки зображення об'єкта, що розглядається. При обертанні макрогвинта за годинниковою стрілкою тубус мікроскопа опускається, при обертанні проти годинникової стрілки піднімається.
Мікрометричний гвинт(Мікровінт) використовують для точної установки зображення об'єкта. Мікрометричний гвинт є однією з частин мікроскопа, що легко ушкоджуються, тому з ним треба звертатися обережно – не обертати з метою грубої установки зображення, щоб уникнути мимовільного опускання тубуса. При повному повороті мікрогвинта тубус пересувається на 0,1 мм.
Оптична частина мікроскопа складається з основних оптичних деталей (об'єктив та окуляр) та допоміжної освітлювальної системи (дзеркало та конденсор).
Об'єктиви(Від лат. objektum– предмет) – найважливіша, цінна та тендітна частина мікроскопа. Вони являють собою систему лінз, укладених у металеву оправу, де вказані ступінь збільшення і числова апертура. Зовнішня лінза, звернена плоскою стороною до препарату, називається передньою. Саме вона забезпечує збільшення. Інші лінзи називаються корекційними і служать для усунення недоліків оптичного зображення, що виникають при розгляді об'єкта, що досліджується.
Об'єктиви бувають сухі та імерсійні, або занурювальні. Сухімназивається об'єктив, у якого між фронтальною лінзою і об'єктом, що розглядається, знаходиться повітря. Сухі об'єктиви зазвичай мають велику фокусну відстань та збільшення 8х або 40х. Іммерсійним(занурювальним) називають об'єктив, у якого між фронтальною лінзою та препаратом знаходиться спеціальне рідке середовище. Внаслідок різниці між показниками заломлення скла (1,52) та повітря (1,0) частина світлових променів заломлюється і не влучає у око спостерігача. Внаслідок цього зображення виходить нечітким, дрібніші структури залишаються невидимими. Уникнути розсіювання світлового потоку можна шляхом заповнення простору між препаратом і передньою лінзою об'єктива речовиною, показник заломлення якого близький до коефіцієнта заломлення скла. До таких речовин відносяться гліцерин (1,47), кедрова (1,51), рицинова (1,49), лляна (1,49), гвоздична (1,53), анісова олія (1,55) та інші речовини. Іммерсійні об'єктиви мають на оправі позначення: I (immersion) – іммерсія, НI (homogen immersion) – однорідна іммерсія, OI (oilimmersion) або МІ- Олійна іммерсія. В даний час як іммерсійна рідина частіше використовують синтетичні продукти, відповідні за оптичними властивостями кедровому маслу.
Об'єктиви розрізняють їх збільшення. Величина збільшення об'єктивів позначена з їхньої оправі (8х, 40х, 60х, 90х). Крім того, кожен об'єктив характеризується певною величиною робочої відстані. Для іммерсійного об'єктиву ця відстань становить 0,12 мм, для сухих об'єктивів зі збільшенням 8х та 40х – 13,8 та 0,6 мм відповідно.
Окуляр(Від лат. okularis– очний) складається з двох лінз – очної (верхньої) та польової (нижньої), укладених у металеву оправу. Окуляр служить збільшення зображення, яке дає об'єктив. Збільшення окуляра позначено з його оправі. Існують окуляри з робочим збільшенням від 4 до 15х.
При тривалій роботі з мікроскопом слід скористатися бінокулярною насадкою. Корпуси насадки можуть розсуватись в межах 55–75 мм залежно від відстані між очима спостерігача. Бінокулярні насадки часто мають власне збільшення (близько 1,5 х) та корекційні лінзи.
Конденсор(Від лат. condenso– ущільнюю, згущаю) складається з двох-трьох короткофокусних лінз. Він збирає промені, що йдуть від дзеркала, і спрямовує їх на об'єкт. За допомогою рукоятки, розташованої під предметним столиком, конденсор може переміщатися у вертикальній площині, що призводить до збільшення освітленості поля зору при піднятому конденсорі та зменшення його при опущеному конденсорі. Для регулювання інтенсивності освітлення в конденсорі є ірисова (пелюсткова) діафрагма, що складається із сталевих серповидних пластинок. При повністю відкритій діафрагмі рекомендується розглядати забарвлені препарати, при зменшеному отворі діафрагми – незабарвлені. Під конденсором розташована відкидна лінзав оправі, що використовується під час роботи з об'єктивами малого збільшення, наприклад, 8х або 9х.
Дзеркаломає дві поверхні, що відбивають - плоску і увігнуту. Воно закріплене на шарнірах на підставі штатива і його можна легко повертати. При штучному висвітленні рекомендується користуватися увігнутою стороною дзеркала, при природному – плоскою.
Освітлювачвиконує функцію штучного джерела світла. Він складається з низьковольтної лампи розжарювання, що закріплюється на штативі, та понижуючого трансформатора. На корпусі трансформатора є рукоятка реостата, що регулює напруження лампи та тумблер для включення освітлювача.
У багатьох сучасних мікроскопах освітлювач вмонтований у основу.
