Рідина хроматографія. Особливості використання методу високоефективної рідинної хроматографії у фармацевтиці Рідина хроматографія сутність методу

(переважно міжмолекулярних) на межі поділу фаз. Як спосіб аналізу, ВЕРХ входить до складу групи методів, яка, зважаючи на складність досліджуваних об'єктів, включає попередній поділ вихідної складної суміші на відносно прості. Отримані прості суміші потім аналізуються звичайними фізико-хімічними методами або спеціальними методами, створеними для хроматографії .

Метод ВЕРХ знаходить широке застосування в таких областях, як хімія, нафтохімія, біологія, біотехнологія, медицина, харчова промисловість, охорона навколишнього середовища, виробництво лікарських препаратів та в багатьох інших.

За механізмом поділу аналізованих або поділюваних речовин ВЕРХ ділиться на адсорбційну, розподільчу, іонообмінну, ексклюзивну, лігандообмінну та інші.

Слід пам'ятати, що у практичній роботі поділ часто протікає по одному, а, по декількома механізмами одночасно. Так, екслюзійний поділ буває ускладнений адсорбційними ефектами, адсорбційний - розподільчими, і навпаки. При цьому чим більша відмінність речовин у пробі за ступенем іонізації, основності або кислотності, за молекулярною масою, поляризацією та іншими параметрами, тим більша ймовірність прояву іншого механізму поділу для таких речовин.

Нормально-фазова ВЕРХ

Нерухома фаза більш полярна, ніж рухлива, тому у складі елюентів переважає неполярний розчинник:

Гексан: ізопропанол = 95:5 (для малополярних речовин)
Хлороформ:метанол = 95:5 (для середньополярних речовин)
Хлороформ:метанол = 80:20 (для сильнополярних речовин)

Обернено-фазова ВЕРХ

Нерухома фаза менш полярна, ніж рухлива, тому у складі елюентів майже завжди присутня вода. В цьому випадку завжди можна забезпечити повне розчинення БАС у рухомій фазі, майже завжди можливо використовувати УФ-детектування, майже всі рухомі фази взаємно змішуються, можна використовувати градієнтне елюювання, можна швидко перерівноважити колонку, колонку можна регенерувати.

Звичайними елюентами для обернено-фазової ВЕРХ є:

Ацетонітрил: вода
Метанол: вода
Ізопропанол: вода

Матриці для ВЕРХ

Як матриці у ВЕРХ використовуються неорганічні сполуки, такі як оксид кремнію (силікагель) або оксид алюмінію, або органічні полімери, такі як полістирол (зшитий дивінілбензолом) або поліметакрилат. Силікагель, звісно, нині загальновизнаний.

Основні характеристики матриці:

Розмір часток (мкм);
Розмір внутрішніх пір (Å, нм).

Отримання силікагелю для ВЕРХ:

Формування мікросфер полікрем'євої кислоти;
Сушіння частинок силікагелю;
Повітряне сепарування.

Частинки сорбенту:

Регулярні (сферичні): вища стійкість до тиску, вища вартість;
Несферичні: нижча стійкість до тиску.

Розмір часу в ВЕРХ - один з найважливіших параметрів. Чим менший розмір пір, тим гірша їхня проникність для молекул речовин, що елююються. А отже, тим гірша сорбційна ємність сорбентів. Чим більше пори, тим, по-перше, менше механічна стійкість частинок сорбенту, а, по-друге, тим менша сорбційна поверхня, отже, гірша ефективність.

Щеплення нерухомої фази

Нормально-фазова ВЕРХ:

Нерухома фаза з пропілнітрильним щепленням (нітрильним);
Нерухома фаза з пропіламінним щепленням (амінною).

Зворотно-фазова ВЕРХ:

Нерухома фаза з алкільним щепленням;
Нерухома фаза з алкілсилільним щепленням.

Енд-кепування - захист нещеплених ділянок сорбенту додатковим щепленням «маленькими» молекулами. Гідрофобний енд-кеппінг (С1, С2): вища селективність, гірша змочуваність; гідрофільний енд-кеппінг (діол): нижче селективність, вища змочуваність.

Детектори для ВЕРХ

Ультрафіолетовий
Діодно-матричний
Флуоресцентний
Електрохімічний
Рефрактометричний
Мас-селективний

Посилання

Wikimedia Foundation. 2010 .

Хроматографія
Розподільча хроматографія

Дивитися що таке "" в інших словниках:

високоефективна рідинна хроматографія- - [А.С.Гольдберг. Англо-російський енергетичний словник. 2006 р.] Тематики енергетика в цілому EN high performance liquid chromatographyHPLC … Довідник технічного перекладача

високоефективна рідинна хроматографія- Термін високоефективна рідинна хроматографія Термін англійською high performance liquid chromatography Синоніми Абревіатури ВЕРХ, HPLC Пов'язані терміни адсорбція, олігопептид, протеоміка, сорбент, фулерен, ендоедральний, хроматографія… …

ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИНА ХРОМАТОГРАФІЯ- рідинна хроматографія, в якій для підвищення ефективності поділу ритель (елюент) під тиском (більше 3х107 Па) прокачують через колонки, заповнені сорбентом з частинками малого діаметра (до 1 мкм), а також використовують перфузійні ...

РІДИНА ХРОМАТОГРАФІЯ- вид хрому тографії, в якій рухомий фазою служитьрідкість (елюент), а нерухомої та. сорбент, тб. носій із нанесеною на його поверхню рідиною або гель. Здійснюють у колонці, заповненій сорбентом (колонова хроматографія), на плоскій… Природознавство. Енциклопедичний словник

Хроматографія- [κρώμα (υрома) колір] процес, заснований на неоднаковій здатності окремих компонентів суміші (рідкої або газоподібної) утримуватись на поверхні адсорбенту як при поглинанні їх з потоку носія, так і при… Геологічна енциклопедія

Хроматографія- (від ін. грецьк... Вікіпедія

хроматографія- Термін хроматографія Термін англійською chromatography Синоніми Абревіатури Пов'язані терміни високоефективна рідинна хроматографія, клатрат, лабораторія на чіпі, порометрія, протеом, протеоміка, сорбент, фермент, фулерен, ендоедральний… … Енциклопедичний словник нанотехнологій

ІОНООБМІННА ХРОМАТОГРАФІЯ- рідинна хроматографія, заснована на разл. можливості іонів, що розділяються, до іонного обміну з фіксир. іонами сорбенту, що утворюються внаслідок дисоціації іоногенних груп останнього. Для поділу катіонів використовують катіоніти, для ... Хімічна енциклопедія

ВЕРХ- високоефективна рідинна хроматографія. Словник скорочень російської мови

ВЕРХ- Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) один з ефективних методів поділу складних сумішей речовин, що широко застосовується як в аналітичній хімії, так і в хімічній технології. Основою хроматографічного поділу є участь … Вікіпедія

Книги

Практична високоефективна рідинна хроматографія, Вероніка Р. Майєр. Представляємо читачеві 5-те видання книги, яке розширено за рахунок сучасних методів та обладнання. У книзі багато доопрацьовано та додано велику кількість посилань. Ті місця у тексті, де…

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) – це метод колонкової хроматографії, в якому рухомою фазою (ПФ) служить рідина, що рухається через хроматографічну колонку, заповнену нерухомою фазою (сорбентом). Колонки для ВЕРХ характеризуються високим гідравлічним тиском на вході в колонку, тому ВЕРХ іноді називають «рідинною хроматографією високого тиску».

Залежно від механізму поділу речовин розрізняють такі варіанти ВЕРХ: адсорбційну, розподільчу, іонообмінну, ексклюзивну, хіральну та ін.

В адсорбційній хроматографії поділ речовин відбувається за рахунок їх різної здатності адсорбуватися та десорбуватися з поверхні адсорбенту з розвиненою поверхнею, наприклад, силікагелю.

У розподільчій ВЕРХ поділ відбувається за рахунок відмінності коефіцієнтів розподілу речовин, що розділяються між нерухомою (як правило, хімічно щепленою до поверхні нерухомого носія) і рухомою фазами.

За полярністю ПФ та НФ ВЕРХ поділяють на нормально-фазову та обернено-фазову.

Нормально-фазовим називають варіант хроматографії, у якому використовуються полярний сорбент (наприклад, силікагель або силікагель з щепленими NH 2 - або CN-групами) та неполярна ПФ (наприклад, гексан з різними добавками). У обернено-фазовому варіанті хроматографії використовують неполярні хімічно модифіковані сорбенти (наприклад, алкільний неполярний радикал C 18) і полярні рухливі фази (наприклад, метанол, ацетонітрил).

В іонообмінній хроматографії молекули речовин суміші, що дисоціювали в розчині на катіони та аніони, поділяються під час руху через сорбент (катіоніт або аніоніт) за рахунок їх різної швидкості обміну з іонними групами сорбенту.

В екслюзійній (ситової, гель-проникаючої, гель-фільтраційної) хроматографії молекули речовин поділяються за розміром за рахунок їх різної здатності проникати в пори нерухомої фази. При цьому першими з колонки виходять найбільші молекули (з найбільшою молекулярною масою), здатні проникати в мінімальну кількість пір нерухомої фази, а останніми виходять речовини з малими розмірами молекул.

часто поділ протікає по одному, а, по декількома механізмами одночасно.

Метод ВЕРХ може застосовуватися для контролю якості будь-яких негазоподібних аналізованих речовин. Для аналізу використовують відповідні прилади – рідинні хроматографи.

До складу рідинного хроматографа зазвичай входять такі основні вузли:

– вузол підготовки ПФ, включаючи ємність з рухомою фазою (або ємності з окремими розчинниками, що входять до складу рухомої фази) та систему дегазації ПФ;

- Насосна система;

- Змішувач рухомої фази (при необхідності);

- Система введення проби (інжектор);

- хроматографічна колонка (може бути встановлена в термостаті);

– детектор;

- Система збору та обробки даних.

Насосна система

Насоси забезпечують подачу ПФ у колонку із заданою постійною швидкістю. Склад рухомої фази може бути постійним або змінним під час аналізу. У першому випадку процес називають изократическим, тоді як у другому – градієнтним. Перед насосною системою іноді встановлюють фільтри з діаметром пір 0,45 мкм для фільтрації рухомої фази. Сучасна насосна система хроматографа рідинного складається з одного або декількох насосів, керованих комп'ютером. Це дозволяє змінювати склад ПФ за певною програмою при градієнтному елююванні. Змішування компонентів ПФ в змішувачі може відбуватися як при низькому тиску (до насосів), так і високому тиску (після насосів). Змішувач можна використовувати для підготовки ПФ та при ізократичному елююванні, проте більш точне співвідношення компонентів досягається при попередньому змішуванні компонентів ПФ для ізократичного процесу. Насоси для аналітичної ВЕРХ дозволяють підтримувати постійну швидкість подачі ПФ колонку в інтервалі від 0,1 до 10 мл/хв при тиску на вході в колонку до 50 МПа. Однак, доцільно, щоб це значення не перевищувало 20 МПа. Пульсації тиску мінімізуються спеціальними демпферними системами, що входять до конструкції насосів. Робочі деталі насосів виготовляються із корозійностійких матеріалів, що дозволяє використовувати у складі ПФ агресивні компоненти.

«Високоефективна рідинна хроматографія забруднювачів природних та стічних вод»

Вступ

Глава 1. Основні поняття та класифікація методів рідинної хроматографії

1.1 Апаратура для рідинної хроматографії

Глава 2. Сутність ВЕРХ

2.1 Застосування

Глава 3. Приклади використання ВЕРХ в аналізі об'єктів довкілля

Глава 4. Апаратура для ВЕРХ

Література

додаток

Вступ

Хроматографічні методичасто виявляються незамінними для ідентифікації та кількісного визначення органічних речовин зі схожою структурою. При цьому найбільш широко використовуються для рутинних аналізів забруднювачів навколишнього середовища є газова та високоефективна рідинна хроматографія. Газохроматографічний аналіз органічних забруднювачів у питній та стічних водах спочатку ґрунтувався на використанні насадочних колонок, пізніше поширення набули і кварцові капілярні колонки. Внутрішній діаметр капілярних колонок зазвичай становить 0,20-0,75 мм, довжина - 30-105 м. Оптимальні результати при аналізі забруднювачів у воді досягаються найчастіше при використанні капілярних колонок з різною товщиною плівки з метилфенілсиліконів з вмістом фенільних груп 5 і 50% . Вразливим місцем хроматографічних методик із використанням капілярних колонок часто стає система введення проби. Системи введення проби можна поділити на дві групи: універсальні та селективні. До універсальних відносяться системи введення з розподілом і без поділу потоку, "холодне" введення в колонку та випаровування при програмуванні температури. При селективному введенні використовують продування з проміжним уловлюванням у пастці, парофазний аналіз тощо. При використанні універсальних систем введення колонку надходить вся проба повністю, при селективної інжекції вводиться лише певна фракція. Результати, одержувані при селективному введенні, є істотно більш точними, оскільки фракція, що потрапила в колонку, містить тільки леткі речовини, і техніка при цьому може бути повністю автоматизована.

Газохроматографічні детектори, що використовуються в моніторингу забруднювачів, часто поділяють на універсальні, що відгукуються на кожен компонент рухомої фази, і селективні, що реагують на присутність в рухомій фазі певної групи речовин зі подібними хімічними характеристиками. До універсальних відносяться полум'яно-іонізаційний, атомно-емісійний, мас-спектрометричний детектори та інфрачервона спектрометрія. Селективними детекторами, що використовуються в аналізі води, є електронно-захоплювальний (селективний до речовин, що містить атоми галогенів), термоіонний (селективний до азот- і фосфоровмісних сполук), фотоіонізаційний (селективний до ароматичних вуглеводнів), детектор з електролітичної провідності містить атоми галогенів, сірки та азоту). Мінімально детектується кількість речовин - від нанограмів до пікограмів в секунду.

Високоефективна рідинна хроматографія(ВЕРХ) є ідеальним методом для визначення великої кількості термічно нестійких сполук, які не можуть бути проаналізовані газовою хроматографією. Об'єктами аналізу методом рідинної хроматографії в даний час часто стають сучасні агрохімікати, до яких входять метилкарбонати та фосфорорганічні інсектициди, інші нелеткі речовини. Високоефективна рідинна хроматографія набуває все більшого поширення серед інших методів, що застосовуються в моніторингу навколишнього середовища, ще й тому, що має блискучі перспективи щодо автоматизації пробопідготовки.

РОЗДІЛ 1. ОСНОВНІ ПОНЯТТЯ І КЛАСИФІКАЦІЯ МЕТОДІВ РІДИНОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ

Рідинну хроматографію поділяють кілька класів залежно від типу носія нерухомої фази. Просте апаратурне оформлення паперової та тонкошарової хроматографій зумовили широке використання цих методів у аналітичній практиці. Однак великі можливості колонкової рідинної хроматографії стимулювали вдосконалення обладнання для цього класичного методу і призвели до швидкого впровадження ВЕРХ. Пропускання елюентів через колонку під високим тиском дозволило різко збільшити швидкість аналізу та суттєво підвищити ефективність поділу за рахунок використання дрібнодисперсного сорбенту. Метод ВЕРХ в даний час дозволяє виділяти, кількісно та якісно аналізувати складні суміші органічних сполук.

За механізмом взаємодії речовини, що розділяється (елюату) з нерухомою фазою розрізняють адсорбційну, розподільчу, іонообмінну, екслюзійну, іон-парну, лігандообмінну і афінну хроматографії.

Адсорбційна хроматографія. Поділ методом адсорбційної хроматографії здійснюється в результаті взаємодії речовини, що розділяється з адсорбентом, таким як оксид алюмінію або силікагель, що мають на поверхні активні полярні центри. Розчинник (елюенти) - неполярна рідина. Механізм сорбції полягає в специфічній взаємодії між полярною поверхнею сорбенту та полярними (або здатними поляризуватися) ділянками молекул аналізованого компонента (рис. 1).

Мал. 1. Адсорбційна рідинна хроматографія.

Розподільча хроматографія. При розподільчому варіанті рідинної хроматографії поділ суміші речовин здійснюється за рахунок відмінності їх коефіцієнтів розподілу між двома фазами, що не змішуються, - елюентом (рухомою фазою) і фазою, що знаходиться на сорбенті (нерухома фаза).

При нормально-фазовимваріанті розподільної рідинної хроматографії використовуються неполярний елюенти та полярні групи, щеплені до поверхні сорбенту (найчастіше силікагелю). Як модифікатори поверхні силікагелю (щеплених фаз) використовуються заміщені алкілхлорсилани, що містять полярні групи, такі як нітрильна, аміногрупа і т. д. (рис. 2). Застосування щеплених фаз дозволяє тонко керувати сорбційними властивостями поверхні нерухомої фази і досягати високої ефективності поділу.

Мал. 2. Розподільна хроматографія з щепленою фазою (нормально-фазний варіант).

Обернено-фазоварідинна хроматографія заснована на розподілі компонентів суміші між полярним елюентом та неполярними групами (довгими алкільними ланцюжками), щепленими до поверхні сорбенту (рис. 3).

Мал. 3. Розподільна хроматографія з щепленою фазою (навернено-фазний варіант).

Менш широко використовують варіант рідинної хроматографії з нанесеними фазами, коли рідка нерухома фаза наноситься на нерухомий носій.

Ексклюзивна (гельпроникна)хроматографія є варіант рідинної хроматографії, в якому поділ речовин відбувається за рахунок розподілу молекул між розчинником, що знаходиться в порах сорбенту і розчинником, що протікає між його частинками.

Афіннахроматографія заснована на специфічних взаємодіях білків (антитіл), що розділяються, з щепленими на поверхні сорбенту (синтетичної смоли) речовинами (антигенів), вибірково утворюючими з білками комплекси (коньюгати).

Іонообмінна, іон-парна, лігандообмінна хроматографії застосовуються в основному в неорганічному аналізі.

Основні параметри хроматографічного поділу.

Основними параметрами хроматографічного поділу є об'єм, що утримується, і час утримування компонента суміші (рис. 4).

Час утримування tR - це час, що минув від моменту введення проби в колонку до виходу максимуму піку. Помноживши час утримування на об'ємну швидкість елюентів F ,отримаємо об'єм VR, що утримується:

Виправлений час утримання - час, що минув з моменту появи максимуму піку несорбируемого компонента до піку відповідної сполуки:

tR" = tR - t0 ;

Наведений або виправлений об'єм утримування - це об'єм утримування з поправкою на мертвий об'єм колонки V0, тобто на об'єм утримування компонента, що не сорбується:

VR" = VR - V0;

Характеристикою утримування є також коефіцієнт ємності k", який визначається як відношення маси речовини в нерухомій фазі до маси речовини в рухомій фазі: k" = mн / mп;

Величину k" легко визначити за хроматограмою:

Найважливішими параметрами хроматографічного поділу є його ефективність та селективність.

Ефективність колонки, що вимірюється висотою теоретичних тарілок (ВЕТТ) і обернено пропорційна їх числу (N) тим вище, ніж пік речовини, що виходить при тому ж часу утримування. Значення ефективності може бути обчислено за хроматограмою за такою формулою:

N = 5.54. (tR / 1/2) 2 ,

де tR- час утримання,

w 1/2 - Ширина піка на половині висоти

Знаючи число теоретичних тарілок, що припадає на колонку, довжину колонки L і середній діаметр зерна сорбенту dc, легко отримати значення висоти, еквівалентної теоретичної тарілці (ВЕТТ) та наведеної висоти (ПВЕТТ):

ВЕТТ = L/N ПВЕТТ = ВЕТТ/d c

Ці характеристики дозволяють порівнювати ефективність колонок різних типів, оцінювати якість сорбенту і якість заповнення колонок.

Селективність поділу двох речовин визначається за рівнянням:

При розгляді поділу суміші двох компонентів важливим параметром є також ступінь поділуRS:

;

Піки вважаються дозволеними, якщо величина RS більша або дорівнює 1.5.

Основні хроматографічні параметри пов'язують наступне рівняння для вирішення:

;

Чинниками, що визначають селективність поділу, є:

1) хімічна природа сорбенту;

2) склад розчинника та його модифікаторів;

3) хімічна структура і властивості компонентів суміші, що розділяється;

4) температура колонки

1.1 Апаратура для рідинної хроматографії

У сучасній рідинній хроматографії використовують прилади різного ступеня складності - від найпростіших систем до хроматографів високого класу, забезпечених різними додатковими пристроями.

На рис. 4. представлена блок-схема рідинного хроматографа, що містить мінімально необхідний набір складових частин, у тому чи іншому вигляді, присутніх у будь-якій хроматографічній системі.

Мал. 4. Блок-схема рідинного хроматографа.

Насос (2) призначений створення постійного потоку розчинника. Його конструкція визначається, перш за все, робочим тиском у системі. Для роботи в діапазоні 10-500 МПа використовуються насоси плунжерного (шприцевого) або пістонного типів. Недоліком перших є необхідність періодичних зупинок для заповнення елюентом, а других – велика складність конструкції та, як наслідок, висока ціна. Для простих систем з невисокими робочими тисками 1-5 МПа з успіхом застосовують недорогі перистальтичні насоси, але так як при цьому важко досягти сталості тиску та швидкості потоку, їх використання обмежене препаративними завданнями.

Інжектор (3) забезпечує введення проби суміші компонентів, що розділяються в колонку з досить високою відтворюваністю. Прості системи введення проби - "stop-flow" вимагають зупинки насоса і тому менш зручні, ніж петлеві дозатори, розроблені фірмою Reodyne.

Колонки (4) для ВЕРХ є товстостінні трубки з нержавіючої сталі, здатні витримати високий тиск. Велику роль відіграє щільність та рівномірність набивання колонки сорбентом. Для рідинної хроматографії низького тиску успішно використовують товстостінні скляні колонки. Постійність температури забезпечується термостатом (5).

Детектори (6) для рідинної хроматографії мають проточну кювету, в якій відбувається безперервне вимірювання будь-якої властивості елюенту, що протікає. Найбільш популярними типами детекторів загального призначення є рефрактометри, що вимірюють показник заломлення, та спектрофотометричні детектори, що визначають оптичну щільність розчинника на фіксованій довжині хвилі (як правило, в ультрафіолетовій області). До переваг рефрактометрів (і недоліків спектрофотометрів) слід віднести низьку чутливість до типу об'єднаної сполуки, яка може і не містити хромофорних груп. З іншого боку, застосування рефрактометрів обмежено ізократичними системами (з постійним складом елюентів), так що використання градієнта розчинників у цьому випадку неможливе.

Колонки для ВЕРХ, які найчастіше використовують у аналізах забруднювачів довкілля, мають довжину 25 див і внутрішній діаметр 4,6 мм, заповнюються вони сферичними частками силікагелю розміром 5-10 мкм з щепленими октадецильными групами. В останні роки з'явилися колонки із меншим внутрішнім діаметром, заповненими частинками меншого розміру. Використання таких колонок призводить до зменшення витрати розчинників та тривалості аналізу, збільшення чутливості та ефективності поділу, а також полегшує проблему підключення колонок до спектральних детекторів. Колонки з внутрішнім діаметром 3,1 мм забезпечують запобіжним картриджем (форколонкою) для збільшення терміну служби та покращення відтворюваності аналізів.

Як детектори в сучасних приладах для ВЕРХ використовуються зазвичай УФ-детектор на діодній матриці, флуоресцентний та електрохімічний.

На практиці, найбільшого поширення набула «наверненофазова» (розподільна) хроматографія, в якій нерухома фаза не полярна, а рухлива полярна (тобто зворотна «прямофазної» хроматографії).

У більшості лабораторій світу групу із 16 пріоритетних ПАУ аналізують методами ВЕРХ чи ХМС.

ГЛАВА 2. СУТНІСТЬ ВЕРХ

У високоефективній рідинній хроматографії (ВЕРХ) характер процесів, що відбуваються в хроматографічній колонці, загалом ідентичний з процесами в газовій хроматографії. Відмінність полягає лише у застосуванні як нерухомої фази рідини. У зв'язку з високою щільністю рідких рухомих фаз і великим опором колонок газова та рідинна хроматографія сильно розрізняються за апаратурним оформленням.

У ВЕРХ як рухомі фази зазвичай використовують чисті розчинники або їх суміші.

Для створення потоку чистого розчинника (або сумішей розчинників), званого рідинної хроматографії елюентом, використовуються насоси, що входять в гідравлічну систему хроматографа.

Адсорбційна хроматографія здійснюється внаслідок взаємодії речовини з адсорбентами, такими як силікагель або оксид алюмінію, що мають на поверхні активні центри. Відмінність у здатності до взаємодії з адсорбційними центрами різних молекул проби призводить до їхнього поділу на зони в процесі руху з рухомою фазою по колонці. Досяжний при цьому поділ зон компонентів залежить від взаємодії як з розчинником, так і з адсорбентом.

Найбільше застосування у ВЕРХ знаходять адсорбенти із силікагелю з різним об'ємом, поверхнею та діаметром пор. Значно рідше використовують оксид алюмінію та інші адсорбенти. Основна причина цього:

Недостатня механічна міцність, що не дозволяє упаковувати та використовувати при підвищених тисках, характерних для ВЕРХ;

силікагель порівняно з оксидом алюмінію має ширший діапазон пористості, поверхні та діаметру пор; Значно більша каталітична активність оксиду алюмінію призводить до спотворення результатів аналізу внаслідок розкладання компонентів проби або їхньої незворотної хемосорбції.

Детектори для ВЕРХ

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) використовується для детектування полярних нелетких речовин, які з будь-яких причин не можуть бути переведені у зручну форму для газової хроматографії, навіть у вигляді похідних. До таких речовин, зокрема, відносять сульфонові кислоти, водорозчинні барвники та деякі пестициди, наприклад, похідні феніл - сечовини.

Детектори:

УФ – детектор на діодній матриці. «Матриця» фотодіодів (їх більше двохсот) постійно реєструє сигнали в УФ і видимій області спектру, забезпечуючи таким чином запис УФ-В-спектрів в режимі сканування. Це дозволяє безперервно знімати при високій чутливості неспотворені спектри компонентів, що швидко проходять через спеціальну комірку.

У порівнянні з детектуванням на одній довжині хвилі, яке не дає інформації про «чистоту» піку, можливості порівняння повних спектрів діодної матриці забезпечують отримання результату ідентифікації з більшим ступенем достовірності.

Флуоресцентний детектор. Велика популярність флуоресцентних детекторів пояснюється дуже високою селективністю і чутливістю, і тим, що багато забруднювачів довкілля флуоресцируют (наприклад, поліароматичні вуглеводні).

Електрохімічний детектор використовуються для детектування речовин, які легко окислюються або відновлюються: феноли, меркаптани, аміни, ароматичні нітро- та галогенпохідні, кетони альдегіди, бензидини.

Хроматографічне поділ суміші на колонці внаслідок повільного просування ПФ займає багато часу. Для прискорення процесу хроматографування проводять під тиском. Цей метод називають високоефективною рідинною хроматографією (ВЖХ)

Модернізація апаратури, що застосовується в класичній рідинної колонкової хроматографії, зробила її одним з перспективних і сучасних методів аналізу. Високоефективна рідинна хроматографія є зручним способом поділу, препаративного виділення та проведення якісного та кількісного аналізу нелетких термолабільних сполук як з малою, так з великою молекулярною масою.

Залежно від типу сорбенту в даному методі використовують 2 варіанти хроматографування: на полярному сорбенті з використанням неполярного елюенту (варіант прямої фази) і на неполярному сорбенті з використанням полярного елюенту - так звана звернено-фазова високоефективна рідинна хроматографія (ОфВЖХ).

При переході елюентів до елюентів рівновага в умовах ОфВЖХ встановлюється набагато швидше, ніж в умовах полярних сорбентів і неводних ПФ. Внаслідок цього, а також зручності роботи з водними та водно-спиртовими елюентами, ОфВЖГ набула нині великої популярності. Більшість аналізів за допомогою ВЖХ проводять саме цим методом.

детектори. Реєстрація виходу з колонки окремого компонента провадиться за допомогою детектора. Для реєстрації можна використовувати зміну будь-якого аналітичного сигналу, що йде від рухомої фази та пов'язаного з природою та кількістю компонента суміші. У рідинній хроматографії використовують такі аналітичні сигнали, як світлопоглинання або світловиділення вихідного розчину (фотометричні та флуориметричні детектори), показник заломлення (рефрактометричні детектори), потенціал та електрична провідність (електрохімічні детектори) та ін.

Безперервно детектований сигнал реєструється самописцем. Хроматограма являє собою зафіксовану на стрічці самописця послідовність сигналів детектора, що виробляються при виході з колонки окремих компонентів суміші. У разі поділу суміші на зовнішній хроматограмі видно окремі піки. Положення піку на хроматограмі використовують для ідентифікації речовини, висоту або площу піку - для цілей кількісного визначення.

2.1 Застосування

Найбільш широке застосування ВЕРХ знаходить у наступних областях хімічного аналізу (виділено об'єкти аналізу, де ВЕРХ практично не має конкуренції):

· Контроль якості продуктів харчування - тонізуючі та смакові добавки, альдегіди, кетони, вітаміни, цукру, барвники, консерванти, гормональні препарати, антибіотики, тріазинові, карбаматні та ін пестициди, мікотоксини, нітрозоаміни, поліциклічні ароматичні вуглеводні і т.п.

· Охорона навколишнього середовища - феноли, органічні нітросполуки, моно-і поліциклічні ароматичні вуглеводні, ряд пестицидів, головні аніони та катіони.

· Криміналістика – наркотики, органічні вибухові речовини та барвники, сильнодіючі фармацевтичні препарати.

· Фармацевтична промисловість – стероїдні гормони, практично всі продукти органічного синтезу, антибіотики, полімерні препарати, вітаміни, білкові препарати.

· Медицина – перелічені біохімічні та лікарські речовини та їх метаболіти в біологічних рідинах (амінокислоти, пурини та піримідини, стероїдні гормони, ліпіди) при діагностиці захворювань, визначенні швидкості виведення лікарських препаратів з організму з метою їх індивідуального дозування.

· Сільське господарство - визначення нітрату та фосфату в ґрунтах для визначення необхідної кількості внесених добрив, визначення поживної цінності кормів (амінокислоти та вітаміни), аналіз пестицидів у ґрунті, воді та сільгосппродукції.

· Біохімія, біоорганічна хімія, генна інженерія, біотехнологія - цукру, ліпіди, стероїди, білки, амінокислоти, нуклеозиди та їх похідні, вітаміни, пептиди, олігонуклеотиди, порфірини та ін.

· Органічна хімія – всі стійкі продукти органічного синтезу, барвники, термолабільні сполуки, нелеткі сполуки; неорганічна хімія (практично всі розчинні сполуки у вигляді іонів та комплексних сполук).

· Контроль якості та безпеки продуктів харчування, алкогольних та безалкогольних напоїв, питної води, засобів побутової хімії, парфумерії на всіх стадіях їх виробництва;

· Визначення характеру забруднень на місці техногенної катастрофи або надзвичайної події;

· Виявлення та аналіз наркотичних, сильнодіючих, отруйних та вибухових речовин;

· визначення наявності шкідливих речовин (поліциклічні та інші ароматичні вуглеводні, феноли, пестициди, органічні барвники, іони важких, лужних та лужноземельних металів) у рідких стоках, повітряних викидах та твердих відходах підприємств та в живих організмах;

· моніторинг процесів органічного синтезу, нафто- та вуглепереробки, біохімічних та мікробіологічних виробництв;

аналіз якості ґрунтів для внесення добрив, наявності пестицидів та гербіцидів у ґрунті, воді та в продукції, а також поживній цінності кормів; складні дослідні аналітичні завдання; одержання мікрокількості надчистої речовини.

ГЛАВА 3. ПРИКЛАДИ ВИКОРИСТАННЯ ВЕРХ В АНАЛІЗІ ОБ'ЄКТІВ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА

ВЕРХ – метод моніторингу ПАУ в об'єктах навколишнього середовища

Для поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАУ), екотоксикантів 1-го класу небезпеки, встановлені вкрай низькі рівні гранично допустимих концентрацій (ГДК) у природних об'єктах. Визначення ПАУ на рівні ГДК і нижче відноситься до дуже складних аналітичних завдань і для їх вирішення застосовуються високотехнологічні методи аналізу (ГХ-МС, ГХ, ВЕРХ). При виборі способу для моніторингу до основним аналізованим параметрам – чутливість і селективність, додаються експресність і економічність, т.к. моніторинг передбачає проведення серійного аналізу. Варіант ВЕРХ на коротких колонках малого діаметра значною мірою відповідає вказаним вимогам. Із застосуванням даного методу авторами розроблено та атестовано методики контролю бенз[a]пірена у трьох природних середовищах: аерозолі, сніговому покриві та поверхневих водах. Для методик характерні: проста уніфікована підготовка проби, що включає екстракцію ПАУ органічними розчинниками і концентрування екстракту, пряме введення сконцентрованого екстракту в хроматографічну колонку, застосування багатохвильового фотометричного детектування в УФ області спектру, ідентифікація піків ПАУ на хроматограмах . Сумарна похибка не перевищує 10 % при визначенні бенз[a]пірена в аерозолі в діапазоні концентрацій від 0.3 до 450 нг/м 3 у поверхневих водах в діапазоні концентрацій від 10 до 1000 нг/л, у сніговому покриві в діапазоні поверхневої щільності. до 50 мкг/м2. Для випадку одночасного визначення пріоритетних ПАУ (до 12 сполук) та реєстрації негомогенних піків аналітів запропоновано повторний поділ екстракту зі зміною селективності рухомої фази, довжини хвилі детектування та температури колонки з урахуванням індивідуальних властивостей ПАУ, що визначається.

1 . Якість навколишнього повітря. Масова концентрація бенз[a]пірена. Методика виконання вимірювань методом ВЕРХ. Свідоцтво про атестацію МВІ №01-2000.

2 . Якість поверхневих та очищених стічних вод. Масова концентрація бенз[a]пірена. Методика виконання вимірювань методом ВЕРХ. Свідоцтво про атестацію МВІ №01-2001.

3 . Якість снігового покриву. Масова концентрація бенз[a]пірена. Методика виконання вимірювань методом ВЕРХ. Свідоцтво про атестацію МВІ №02-2001.

Видалення аніліну з водних розчинів із використанням відходів алюмотермічного відновлення прокатної мідної окалини

Проблема видалення вуглеводнів зі стічних вод є актуальним завданням. У багатьох хімічних, нафтохімічних та інших виробництвах утворюються анілін та його похідні, які є токсичними речовинами. Анілін - сильноотруйна речовина, ГДК - 0,1 мг/м 3 . Анілін та його похідні розчиняються у воді, тому не можуть бути видалені гравітаційним осадженням.

Одним з кращих методів очищення стічних вод від органічних забруднювачів є застосування неорганічних та органічних адсорбентів, здатних регенеруватися (алюмосилікати, модифіковані глини, деревина, волокна і т. д.) і нездатних до регенерації (активоване вугілля, макропористі полімерні матеріали і т.д. ).

Адсорбенти, що регенеруються, можуть видалити з води органічні речовини різної полярності. Пошук ефективних адсорбентів є актуальним завданням.

У цьому повідомленні представлені результати дослідження в галузі застосування прокатної мідної окалини Єреванського кабельного заводу (ОПМОЄрКЗ) як сорбентів аніліну.

Хроматографічні дослідження проводили на хроматографі ВЕРХ / високоефективна рідинна хроматографія / системи (Waters 486 - detector, Waters 600S - controller, Waters 626 - Pump), на колонці 250 х 4 мм наповненими досліджуваними нами сорбентами 1 швидкість є досліджувані нами розчинники, детектор - UV-254. УФ-спектроскопічний аналіз проведено на спектрофотометрі Specord-50, спектри отримані за допомогою комп'ютерної програми ASPECT PLUS.

Точно зважені порції сорбентів вносили певні обсяги аніліну у воді, початкові концентрації яких варіювали. Суміш ретельно збовтували протягом 6 год. Далі пробу залишали для відстою. Адсорбція завершується практично протягом 48 годин. Кількість осадженого аніліну визначена УФ-спектрофотометричним, а також рефрактометричним аналізом.

Спочатку були досліджені адсорбційні властивості ОПМОЕРКЗ при видаленні аніліну з розчину в тетрахлорметані. Виявилося, що анілін найкраще поглинає сорбент 3 (таблиця).

Проведено також вимірювання для водних розчинів аніліну в концентраціях 0,01-0,0001 моль/л. У таблиці наведено дані з 0,01 М розчину.

Поглинання аніліну різними сорбентами 0,01 М водного розчину аніліну при 20°С

Раніше було встановлено, що адсорбція у зазначених межах концентрацій зростає та лінійно залежить від коефіцієнта заломлення. Кількість аніліну було визначено з графічної залежності «коефіцієнт заломлення – молярна концентрація» та скориговано даними як рідинної хроматографії, так і УФ-спектрального аналізу.

Найбільш активним для водних розчинів є сорбент 3. Кількість адсорбованого забруднювача розраховувалося як різниця між загальною кількістю забруднювача, доданого в початковий розчин, та його залишком у кінцевому розчині.

Методи визначення ПАУ в об'єктах довкілля

Як правило для визначення ПАУ використовуються методи газової хроматографії (ГХ) та високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). поділ основних 16 ПАУ, достатній для кількісного аналізу, досягається застосуванням або капілярних колонок у газовій хроматографії, або високоефективних колонок, що застосовуються в ВЕРХ. Необхідно пам'ятати, що колонка, яка добре розділяє калібрувальні суміші шістнадцяти ПАУ не гарантує, що вони також добре розділятимуться на тлі супутніх органічних сполук у досліджуваних пробах.

З метою спрощення аналізу, а також для досягнення високої якості результатів, більшість аналітичних процедур містить етап попереднього виділення (сепарації) ПАУ серед інших груп супутніх сполук у пробах. Найчастіше в цих цілях використовуються методи рідинної хроматографії низького тиску в системі рідина-тверде тіло або рідина-рідина з використанням механізмів адсорбції, наприклад з використанням силікагелю або окису алюмінію, іноді використовуються змішані механізми, наприклад, адсорбції та виключення із застосуванням сефадексів.

Використання попереднього очищення проб дозволяє при визначенні ПАВ уникнути впливу:

Повністю неполярних сполук, таких як аліфатичні вуглеводні;

Помірно та сильно полярних сполук, наприклад, фталанів, фенолів, багатоатомних спиртів, кислот;

Високомолекулярних сполук, таких, як, наприклад, смоли.

У високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) використовуються переважно два типи детекторів: флуориметричний детектор або спектрофотометричний детектор з фотодіодною лінійкою. Межа виявлення ПАУ при флуориметричному детектуванні дуже низька, що робить цей метод особливо придатним для визначення слідових кількостей поліароматичних сполук. Однак класичні флуориметричні детектори практично не дають інформації про будову досліджуваного з'єднання. Сучасні конструкції уможливлюють реєстрацію спектрів флуоресценції, які характерні для індивідуальних сполук, але вони поки не набули широкого поширення в практиці рутинних вимірювань. Спектрофотометричний детектор з фотодіодною лінійкою (ФДЛ) дає можливість реєстрації спектрів поглинання в УФ і видимому спектральному діапазоні, ці спектри можуть використовуватися для ідентифікації. Аналогічна інформація може бути отримана з використанням детекторів, що швидко сканують.

При виборі аналітичної техніки, призначеної для поділу, ідентифікації та кількісного аналізу згаданих ПАВ необхідно враховувати такі умови:

Рівень визначених змістів у досліджуваних пробах;

Кількість супутніх субстанцій;

Застосовувана аналітична процедура (методика виконання вимірів);

Можливість серійної апаратури.

Розробка методики визначення лужноземельних елементів та магнію методом іонної високоефективної рідинної хроматографії.

Розробка та вдосконалення методів, що дозволяють вирішувати завдання аналізу вод - важлива проблема аналітичної хімії. Розвиток високоефективної рідинної хроматографії високого тиску стимулював розвиток нового напрямку в іонообмінній хроматографії - так званої іонної хроматографії. Синтез сорбентів для іонної хроматографії утруднений, оскільки до них пред'являється чимало вимог. У зв'язку з відсутністю комерційно доступних високоефективних катіонітів, була використана динамічно модифікована обернена фаза, для чого був синтезований модифікатор: N-гексадецил-N-деканоїл-параміно-беноілсульфокислоти етил-діізопропіламоній (ДГДАСК), де гідрофобний амін, що містить групу здатний до катіонного обміну. Після пропускання розчину модифікатора поглинання при l = 260 нм досягало 64 одиниць оптичної щільності (° Е) з виходом на плато. Розрахована іонообмінна ємність становить 1565 мкмоль. Так як катіони лужноземельних елементів і магнію не поглинають в УФ області спектру, використовувалася непряма УФ детекція із застосуванням синтезованого УФ поглинаючого елюенту 1,4 дипиридинийбутана броміду (ДПБ бромід). Так як галоген-іони руйнують сталеві частини колонки, то бромід-іон 1,4-дипіридінійбутану замінили на ацетат-іон. При промиванні колонки елюентом відбувається заміна протиіону модифікатора-етилдіізопропіламонію на УФ-поглинаючий іон 1,4-дипіридинійбутан. Поділ катіонів здійснювали за оптимальної довжини хвилі l = 260 нм на шкалі 0,4 А в режимі “складання шкали”; полярність самописця змінювали на зворотний. Поділ всіх катіонів, що вивчаються, досягнуто при веденні комплексоутворюючої добавки-щавлевої кислоти. Межі виявлення Mg 2+ Ca 2+ Sr 2+ Ba 2+ становлять 8 мкг/л; 16 мкг/л; 34 мкг/л; 72 мкг/л відповідно. В обраних умовах проаналізовано водопровідну воду, вміст Ca 2+ в якій становить 10,6 +1,9 мг-іон/л, Mg 2+ -2,5 + мг-іон/л. Помилка відтворюваності не перевищує Ca 2+ -2,2%, для Mg 2+ - 1,4%.

Аналіз комплексів кадмію у навколишньому середовищі

Для вивчення механізмів міграції важких металів у біосфері необхідні дані про хімічні форми існування металів у природі. Складнощі при аналізі сполук одного з найтоксичніших металів – кадмію – пов'язані з тим, що він утворює неміцні комплекси, і при спробі їх виділити спотворюються природні рівноваги. У даній роботі сполуки кадмію в ґрунті та рослинах досліджені за допомогою методики, що базується на хроматографічному поділі екстрактів з подальшою ідентифікацією компонентів методами хімічного аналізу. Такий підхід дозволив як ідентифікувати хімічні форми кадмію, а й простежувати їх трансформації в об'єктах довкілля.

З кадмієм в об'єктах біосфери координуються ОН-групи вуглеводів та поліфенолів (включаючи флавоноїди), С=О, фосфати, NH 2 , NO 2 , SH-групи. Для цілей цього дослідження було складено набір модельних лігандів, які представляють ці класи сполук. Взаємодія модельних лігандів з водорозчинними солями кадмію була досліджена методами СФ спектроскопії та ВЕРХ.

Для виділення сполук кадмію використовували екстракцію спеціально підібраними розчинниками (не утворюють комплексів з Cd). Так вдається відокремити кадмій від усіх важких металів, крім його хімічного аналога – цинку. Кадмій- та цинк, що містять піки на хроматограмах отриманих екстрактів, виявляли за допомогою зв'язування металів у вигляді їх дитизонатів. Для відокремлення від цинку використовували відмінність у стійкості комплексів Cd та Zn при рН 6-8. Виділені сполуки Cd ідентифікували методом ВЕРХ із зміною рН у процесі елюювання. Був виконаний аналіз сполук кадмію з компонентами ґрунтів та тканин рослин, а також ідентифіковані речовини, що виробляються рослинами у відповідь на збільшення надходження кадмію із ґрунту. Показано, що у злаків захисними агентами є флавоноїди, зокрема трицин, у бобових – алкоксипохідні цистеїну, у хрестоцвітих – як поліфеноли, так і тіоли.

ГЛАВА 4. АПАРАТУРА ДЛЯ ВЕРХ

СЕРІЯ ACCELA

Новий надвисокоефективний рідинний хроматограф ACCELA здатний працювати в найширшому діапазоні сокростей потоків і тисків, забезпечуючи як типове для ВЕРХ поділ на звичайних колонках, так і надшвидке та ефективне поділ на колонках з розміром частинок сорбенту менше 2 мкм при сверхвы.

Система включає квотернарний градієнтний інетрний насос, здатний створювати тиск понад 1000 атм та з об'ємом затримки всього 65 мкл, що забезпечує високошвидкісний хроматографічний поділ. Автосамплер ACCELAздатний працювати в циклі інжекції зразка 30 секунд і забезпечує високу відтворюваність введення. Діодно-матричний детектор Accela PDAз мінімізованим обсягом проточного осередку (2 мкл) оптимізований для роботи в режимі високошвидкісної хроматографії, використовує патентовану технологію LightPipe і забезпечує збереження симетричної форми піків, що дає використання бездоганних хроматографічної системи та колонок.

Система ідеально з'єднується з мас-спектрометрами для створення найпотужніших та найкращих з доступних у світі систем ВЕРХ/МС.

Колонки для роботи в режимі надвисокоефективної хроматографії з розміром зерна 1.9 мкм доступні від Thermo Electron для будь-яких застосувань.

СЕРІЯ TSP

Модульний принцип побудови приладів ВЕРХ дозволяє замовнику гнучко комплектувати обладнання для вирішення будь-яких аналітичних завдань, а при їх зміні оперативно та економічно його модифікувати. Широкий вибір модулів включає насоси - від ізократичного до чотирикомпонентного градієнтного, від мікроколонного до напівпрепаративного, всі доступні детектори, системи введення зразка - від ручних інжекторів до автосамплерів з можливістю будь-яких маніпуляцій із зразками, потужне програмне забезпечення для обробки результатів. Всі модулі сертифіковані за CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, вони компактні, мають сучасний дизайн, прості в управлінні, оснащені вбудованим дисплеєм і системою самодіагностики, дозволяють створювати та зберігати в пам'яті методи завдання параметрів. Вони відповідають критеріям "Зразкової Лабораторної Практики" (GLP) та занесені до Реєстру Вимірювальних засобів РФ. Протоколи вимірів видаються відповідно до Фармакопеїв Англії, США, Німеччини та Франції.

Модульні системи TSP відрізняються високою надійністю та стійкістю в експлуатації.

Поєднання модулів забезпечує аналітика всіма перевагами інтегральної системи, з одного боку, та гнучкістю модульної системи з іншого. У якій би галузі застосування Високоефективної рідкої хроматографії (ВЕРХ) -фармакологія, біотехнологія, аналіз об'єктів навколишнього середовища, клінічний аналіз, аналіз харчових продуктів і напоїв, аналіз нафтохімічної та хімічної продукції - не використовувався цей прилад, він завжди оптимально конфігурується для того, щоб відповідати найвищим вимогам.

Як дослідна, так і високопродуктивна рутинна системи забезпечують:

Високоефективну дегазацію розчинника

Можливість роботи з малими та надмалими кількостями зразка

Високу чутливість, як з УФ/ВИД детектором, так і з діодною матрицею (зі знаменитою технологією LightPipe з довжиною оптичного шляху 1 або 5 см на вибір)

Роботу з різними колонками

Високу точність кількісного аналізу

Можливість автоматичної роботи з різними обсягами зразка

Середньоквадратичну помилку за часом утримання менше 0.3%

Мінімальну робочу площу, яку займає система

Високу надійність та стабільність параметрів.

Surveyor LC Pump- ВЕРХ насос, що має кращі показники відтворюваності часів утримання серед усіх доступних у світі чотирикомпонентних градієнтних насосів. Інтегрований чотириканальний вакуумний дегазатор та демпфер пульсацій забезпечують чудову стабільність базової лінії для досягнення максимальної чутливості та точності кількісного аналізу.

Автодозатор забезпечує високу продуктивність та гнучкість аналізу. Широкий вибір піддонів для зразків - від стандартних віал до 96- та 384-лункових мікропластин - покриває потреби практично всіх застосувань. Нова технологія забезпечує введення проби практично без втрат, практично 5 мкл зразка вводяться автодозатором з повного об'єму зразка 5 мкл.

SURVEYOR

УФ/вид детектор і PDA (детектор з діодною матрицею)

Surveyor UV/Vis- детектор ультрафіолетового та видимого світла зі змінною довжиною хвилі є комбінацією економічності та надійності з найвищою чутливістю LightPipe технології. Широкий вибір проточних кювет робить цей детектор універсальним для всіх застосувань від тих, що використовують капілярну або мікроколоночну хроматографію до напівпрепаративних та препаративних.

Surveyor PDAдетектор є найчутливішим серед усіх ВЕРХ детекторів, які використовують діодну матрицю. Оптика з дволамповим джерелом покриває безперервно весь діапазон довжин хвиль від 190 до 800 нм. Волоконно-оптичний формувач світлового пучка забезпечує чудовий оптичний дозвіл без принесення в жертву чутливості.

Surveyor RIрефрактометричний детектор із термостатованою кюветою мінімального об'єму з повним електронним контролем із комп'ютера.

Surveyor FLфлуориметричний скануючий детектор з високою чутливістю та можливістю детекції при флюоресценції, хемілюмінесценції та фосфоресценції.

Широкий вибір автосемплерів дозволяє працювати як зі звичайними віалами, так і 96-позиційними планшетами, що широко використовуються в біохімії та клінічній практиці. p align="justify"> Робота з ними полегшується завдяки застосуванню аналогічних планшетів для підготовки проб методом твердофазної екстракції.

400 Електричний привід, петля Valco (20 мкл – стандарт) з можливістю часткового заповнення.

Карусель 96 зразків.

Електричний привід, термостат колонки, петля Valco (100 мкл – стандарт) з можливістю часткового заповнення. Режим AutoMix для підготовки проб. Карусель для зразків: 84 х 2 мл (зразки) + Зх 10 мл (реагенти). Вбудований термостат стовпчика. 420

Петлевий автосемплер для досліджень з можливістю роботи в режимах повного, часткового заповнення та введення мікролітрових проб. Широкий вибір каруселів (стандартна – 96 зразків).

Планшетний автосемплер для роботи з 96- та 384-позиційними планшетами. Введення проби в петлю під тиском, можливість введення проб не менше 1 мкл. Можливість встановлення податчика планшетів. ВЕРХ

Основні виробники обладнання для ВЕРХ

· Waters – надпродуктивна хроматографія, мас-спектрометрія, колонки, твердофазна екстракція;

· Varian, Inc. - хроматографи та колонки, аксесуари для твердофазної екстракції;

· Agilent Technologies - хроматографи та колонки;

· Hypersil - колонки та сорбенти.

· Merck KGaA - ТСХ пластини та аксесуари для ТСХ, колонки, сорбенти рухомі фази для ВЕРХ, аксесуари для твердофазної екстракції

· Dionex - обладнання та колонки для ВЕРХ, особливо для іонної хроматографії.

Література

1.Пилипенко А.Т., П'ятницький І.В. Аналітична хімія. У двох книгах: кн..1 - М.: Хімія, 1990-480с.

1. Пилипенко А.Т., П'ятницький І.В. Аналітична хімія. У двох книгах: кн..2 - М.: Хімія, 1990-480с.

2. Васильєв В.П. Аналітична хімія. У 2 год. Ч. 2. Фізико - хімічні методи аналізу: Навч. для Хімка – технол. спец. вишів. - М.: Вищ. шк., 1989. - 384с.

3. Гідрохімічні матеріали. Том 100. Методи та технічні засоби оперативного моніторингу якості поверхневих вод. Л.: Гідрометео-видав, 1991. - 200с.

4. Лур'є Ю.Ю. Аналітична хімія виробничих стічних вод/Ю.Ю. Лур'є; М.: ХіміяЮ, 1984. - 448с.

5. Юінг Г. Інструментальні методи хімічного аналізу/Пер. з англ. М.: Світ, 1989. - 348 с.

6. Горелік Д.О., Конопелько Л.А., Панков Е.Д. Екологічний моніторинг У 2 т. СПб.: Крісмас. 2000. - 260 с.

7. Айвазов Б.В. Введення у хроматографію. М: Вища. шк., 1983. - 450 с.

8. Гольдберг К.А., Вігдергауз М.С. Введення у газову хроматографію. М.: Хімія, 1990. - 329 с.

9. Столяров Б.В. та ін // Практична газова та рідинна хроматографія. СПб.: СПбГУ, 1998. – С. 81.

11. Горшков А.Г., Маринайте І.І. ВЕРХ – метод моніторингу ПАУ в об'єктах навколишнього середовища

12. Торосян Г. О., Мартіросян В. А., Алексанян А. Р., Закарян М. О.

13. Л.А. Туркіна, Г.М. Корольова Розробка методики визначення лужноземельних елементів та магнію методом іонної високоефективної рідинної хроматографії

14. Дульцева Г.Г., Дубцова Ю.Ю., Скубнєвська Г.І. Аналіз комплексів кадмію у навколишньому середовищі

додаток

ВИЗНАЧЕННЯ КЛОМАЗОНУ У ВОДІ ХРОМАТОГРАФІЧНИМИ МЕТОДАМИ

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ МУК 4.1.1415-03

1. Підготовлено: Федеральним науковим центром гігієни ім. Ф.Ф.

Ерісмана; Московською сільськогосподарською академією ім. К.А.

Тимірязєва; за участю Департаменту Держсанепіднагляду МОЗ Росії. Розробники методики вказані наприкінці.

3. Затверджено Головним державним санітарним лікарем

Російської Федерації, Першим заступником Міністра охорони здоров'я Російської Федерації, акад. РАМН Г.Г. Онищенка 24 червня 2003 р.

5. Введені вперше.

1. Вступна частина

Фірма-виробник: ФМС (США).

Торгова назва: КОММАНД.

Діюча речовина: кломазон.

2-(2-хлорбензил)-4,4-диметил-3-ізоксалідин-3-он(ІЮПАК)

Світло-коричнева в'язка рідина.

Температура плавлення: 25-С.

Температура кипіння: 275-С.

Тиск парів при 25-С: 19,2 мПа.

Коефіцієнт розподілу н-октанол/вода K logP = 2,5.

Добре розчинний в ацетоні, гексані, етанолі, метанолі,

хлороформі, дихлорметані та ацетонітрилі; розчинність у воді -

1,10 г/куб. дм. Стабільний при кімнатній температурі щонайменше 2 років, при 50 -З - щонайменше 3 місяців.

Коротка токсикологічна характеристика: Гостра пероральна

токсичність (LD) для щурів – 1369 – 2077 мг/кг; гостра дермальна

токсичність (LD) для щурів – понад 2000 мг/кг; гостра

інгаляційна токсичність (LC) для щурів – 4,8 мг/куб. дм (4 год).

Гігієнічні нормативи. ГДК у воді – 0,02 мг/куб. дм.

Область застосування препарату. Кломазон - гербіцид вибіркової дії, що застосовується для боротьби зі злаковими та дводольними бур'янами у посівах сої та рису при довсходовом або передпосівному внесенні.

2. Методика визначення кломазону у воді

хроматографічними методами

2.1. Основні положення

2.1.1. Принцип методики

Методика заснована на вилученні кломазону з аналізованої проби гексаном, концентруванні екстракту та подальшому кількісному визначенні альтернативними методами:

високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ) з

ультрафіолетовим детектором, газорідинною хроматографією (ГЖХ) з детектором постійної швидкості рекомбінації або тонкошарової хроматографії (ТЗХ). Кількісне визначення проводиться методом абсолютного калібрування.

2.1.2. Вибірковість методу

У пропонованих умовах метод специфічний у присутності глобальних забруднювачів навколишнього середовища: хлорпохідні циклопарафінів (ізомери ГХЦГ), сполук дифенільного ряду (ДДТ та його похідні), їх метаболітів - поліхлорованих бензолів і фенолів, а також у присутності трихлорацетату якість гербіциду.

2.1.3. Метрологічна характеристика методу (Р = 0,95)

Реактиви, розчини та матеріали

Кломазон із вмістом буд. 99,8%

(ФМС, США)

Азот, оч ГОСТ 9293-79

Аміак водний, 25%-ний, ч ГОСТ 1277-81

Ацетон, ч ГОСТ 2603-79

н-Гексан, ч ГОСТ 2603-79

Водню пероксид, 30%-ний водний розчин ГОСТ 10929-77

Ізопропіловий спирт, хч ТУ 6-09-402-75

Кислота сірчана, хч ГОСТ 4203-77

Кислота хлороводнева (соляна), хч ГОСТ 3118-77

Метиловий спирт, хч ГОСТ

Натрію гідроксид, хч, 25% водний розчин ГОСТ 4323-77

Натрію сульфат безводний, хч ГОСТ 1277-81

Срібла нітрат, хч ГОСТ 1277-81

2-Феноксіметанол, год ТУ 6-09-3688-76

Хроматон N-AW-DMCS (0,16 – 0,20 мм)

з 5% SE-30, Хемапол, Чехія

Хроматон N-AW-DMCS (0,16 – 0,20 мм) з 1,5

ОV-17 + 1,95% QF-1, Хемапол, Чехія

Платівки для ВЕТСГ (СРСР)

Платівки "Кізельгель 60 F-254" (ФРН)

Платівки "Силуфол" Чехія

Паперові фільтри "біла стрічка", знезолені та попередньо промиті гексаном ТУ 6-09-2678-77

2.3. Прилади, апаратура, посуд

Рідкісний хроматограф Міліхром

з ультрафіолетовим детектором

Хроматографічна колонка сталева,

довжиною 64 мм, внутрішнім діаметром 2 мм,

заповнена Силасорб 600, зерненням 5 мкм

Хроматограф газовий серії "Колір" або

аналогічний, з детектором постійної

швидкості рекомбінації (ДПР) з межею

детектування за лінданом 4 x 10 г/куб. см

Хроматографічна колонка скляна, довжиною

1 або 2 м, внутрішнім діаметром 2 – 3 мм

Мікрошприц типу МШ-10, місткістю 10 мкл ТУ 5Е2-833-024

Апарат для струшування типу АВУ-6С ТУ 64-1-2851-78

Лазня водяна ТУ 64-1-2850-76

Ваги аналітичні типу ВЛА-200 ГОСТ 34104-80Е

Камера хроматографічна ГОСТ 10565-74

Насос водоструминний ГОСТ 10696-75

Опромінювач ртутно-кварцовий типу ОКН-11 ТУ 64-1-1618-77

Пульверизатори скляні ГОСТ 10391-74

Ротаційний вакуумний випарник ІР-1М

або аналогічний ТУ 25-11-917-76

Установка компресорна ТУ 64-1-2985-78

Шафа сушильна ТУ 64-1-1411-76Е

Вирви ділильні ГОСТ 3613-75

Колби мірні місткістю 100 мл ГОСТ 1770-74

Циліндри мірні, місткістю 10, 50 мл ГОСТ 1770-74Е

Колби грушоподібні зі шліфом,

місткістю 100 мл ГОСТ 10394-72

Колби конічні місткістю 100 мл ГОСТ 22524-77

Пробірки центрифужні, мірні ГОСТ 25336-82Е

Піпетки, місткістю 0,1, 1, 2, 5 та 10 мл ГОСТ 20292-74

Вирви хімічні, конусні, діаметром

34 - 40 мм ГОСТ 25336-82Е

2.4. Відбір проб

Відбір, зберігання та підготовка проб проводяться відповідно до

"Уніфікованими правилами відбору проб сільськогосподарської продукції, харчових продуктів та об'єктів довкілля для визначення мікрокількостей пестицидів", затвердженими за N 2051-79 від 21.08.79

Відібрані проби можна зберігати у холодильнику трохи більше 5 днів. Перед аналізом воду (за наявності суспензії) фільтрують через нещільний паперовий фільтр.

2.5. Підготовка до визначення

2.5.1. Метод ВЕРХ

2.5.1.1. Підготовка рухомої фази для ВЕРХ

У мірну колбу місткістю 100 мл поміщають за допомогою піпетки 5 мл ізопопанолу і 5 мл метанолу, доливають гексаном до мітки, перемішують, фільтрують.

2.5.1.2. Кондиціювання колонки

Промити колонку для ВЕРХ сумішшю гексан-метанол-ізопропанол (90:5:5, за обсягом) протягом 30 хв. при швидкості подачі розчинника 100 мкл/хв.

2.5.2. Метод ГЖХ. Підготовка та кондиціювання колонки

Готову насадку (5% SE-30 на Хроматоні N-AW-DMCS) засипають у скляну колонку, ущільнюють під вакуумом, колонку встановлюють у термостаті хроматографа, не під'єднуючи до детектора, і стабілізують в струмі азоту при температурі 250 -3 протягом 10 12 год.

2.5.3. Метод ТСХ

2.5.3.1. Приготування реагентів, що виявляють

2.5.3.1.1. Реагент, що виявляє N 1

1 г нітрату срібла розчиняють в 1 мл дистильованої води, додають 10 мл 2-феноксиметанолу, 190 мл ацетону, 1 - 2 краплі пероксиду водню, розчин перемішують і переносять у склянку темного скла.

2.5.3.2.2. Проявляє реагент N 2

0,5 г нітрату срібла розчиняють у 5 мл дистильованої води в мірній колбі на 100 мл, додають 10 мл 25% водного аміаку, розчин доводять до 100 мл ацетоном, перемішують і переносять у склянку з темного скла.

2.5.3.2. Приготування рухомої фази для ТШХ

У мірну колбу місткістю 100 мл вносять 20 мл ацетону і додають до мітки гексан, перемішують. Суміш наливають у хроматографічну камеру шаром трохи більше 6 - 8 мм за 30 хв. До початку хроматографування.

2.5.4. Приготування стандартних розчинів

Основний стандартний розчин кломазону з вмістом 100 мкг/мл готують розчиненням 0,010 г препарату, що містить 99,8% д. в., в гексані у мірній колбі на 100 мл. Розчин зберігається у холодильнику протягом місяця.

Робочі стандартні розчини з концентрацією 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0; 20 та 40,0 мкг/мл готують з основного стандартного розчину кломазону відповідним послідовним розведенням гексаном.

Робочі розчини зберігають у холодильнику трохи більше місяця.

2.5.5. Побудова градуювального графіка

2.5.5.1. Градуювальний графік А (вимірювання за п. 2.7.1, ВЕРХ)

Для побудови градуювального графіка інжектор хроматографа вводять по 5 мкл робочого стандартного розчину кломазону з концентрацією 4,0; 10,0; 20,0 та 40 мкг/мл.

2.5.5.2. Градуювальний графік (вимірювання за п. 2.7.2, ГЖХ)

Для побудови градуювального графіка випарник хроматографа вводять по 5 мкл робочого стандартного розчину кломазону з концентрацією 0,4; 1,0; 2,0; 4,0 та 10,0.

Здійснюють не менше 5 паралельних вимірів. Знаходять середнє значення висоти хроматографічного піку кожної концентрації. Будують градуювальний графік (А або В) залежності висоти хроматографічного піку мм від концентрації кломазону в розчині в мкг/мл.

2.6. Опис визначення

100 мл аналізованої проби води поміщають у ділильну вирву місткістю 250 мл, доливають 10 мл 25%-ного водного розчину гідроксиду натрію, перемішують і додають 20 мл н-гексану. Воронку струшують протягом 3 хв., після поділу фаз гексановий шар зливають в грушоподібну колбу місткістю 100 мл, пропускаючи через шар безводного сульфату натрію, поміщеного в конічній воронці на складчастому паперовому фільтрі. Вилучення препарату з водної проби повторюють ще двічі, використовуючи по 20 мл н-гексану. Об'єднаний гексановий екстракт упарюють на ротаційному вакуумному випарнику при температурі 40 -З майже насухо, залишок віддувають потоком повітря або азоту особливої чистоти. Сухий залишок розчиняють у 0,1 (ВЕРХ, ТШХ) або 0,25 мл (ГРХ) н-гексану і аналізують одним із хроматографічних методів.

2.7. Умови хроматографування

Рідкісний хроматограф з ультрафіолетовим детектором Міліхром (Росія).

Колонка сталева довжиною 64 мм, внутрішнім діаметром 2 мм,

заповнена Силасорб 600, зерненням 5 мкм.

Температура стовпчика: кімнатна.

Рухлива фаза: гексан-ізопропанол-метанол (90:5:5, за обсягом).

Швидкість потоку елюентів: 100 мкл/хв.

Довжина хвилі: 240 нм.

Чутливість: 0,4 од. абсорбції на шкалу.

Об'єм проби, що вводиться: 5 мкл.

Час виходу кломазону: близько 6 хв.

Лінійний діапазон детектування: 20 – 200 нг.

Зразки, що дають піки більші, ніж стандартний розчин з концентрацією 40 мкг/мл, розбавляють рухомий фазою ВЕРХ.

Хроматограф газовий "Колір-570" з детектором постійної швидкості рекомбінації іонів.

Колонка скляна довжиною 1 м, внутрішнім діаметром 3 мм, заповнена Хроматон N-AW-DMCS з 5% SE-30 (0,16 - 0,20 мм).

Робоча шкала електрометра 64 х 10 10Ом.

Швидкість руху стрічки самописця 200 мм/год.

Температура термостата колонки – 190-С

детектора - 300-С

випарника - 220-С

Швидкість газу-носія (азота) – 60 мл/хв.

Об'єм проби, що вводиться - 5 мкл.

Час виходу кломазону – 2,5 хв.

Лінійний діапазон детектування: 2 – 50 нг.

Зразки, що дають піки більші, ніж стандартний розчин з концентрацією 10 мкг/мл, розбавляють гексаном.

Для підвищення точності ідентифікації кломазону при спільній присутності в пробі гамма-ГХЦГ, що має близький час утримування, кломазон видаляється з проби обробкою концентрованою сірчаною кислотою. Повторний аналіз проби дозволяє встановити вклад кломазону у первинний хроматографічний сигнал.

Гексановий розчин у колбі, отриманий за п. 2.6 кількісно

(або його аліквотну частину) наносять на хроматографічні пластинки "Силуфол", "Кізельгель 60F-254" або "Пластинки для ВЕТСХ". Поряд наносять стандартні розчини в об'ємі, що відповідає вмісту кломазону 1, 2, 5 та 10 мкг. Пластинку поміщають у камеру для хроматографування, що містить суміш н-гексан-ацетон (4:1 за обсягом). Після розвитку хроматограми платівку виймають з камери, поміщають її під тягу до випаровування розчинників, потім обробляють одним з реагентів, що виявляють, і поміщають під ультрафіолетову лампу на 5 хв. Зона локалізації препарату на пластинках "Силуфол", "Пластинках для ВЕТСХ" та "Кізельгель 60F-254" проявляється у вигляді сіро-бурих плям з величиною Rf 0,35, 0,85 та 0,43, відповідно. Для визначення кломазону методом ТСХ можна використовувати платівки "Алюграм" та "Поліграм" (виробництва ФРН). Величина Rf кломазону цих пластинках становить 0,37 і 0,38, відповідно.

3. Вимоги техніки безпеки

Необхідно дотримуватись загальноприйнятих правил безпеки при роботі з органічними розчинниками, токсичними речовинами, електронагрівальними приладами.

4. Контроль похибки вимірів

Оперативний контроль похибки та відтворюваності вимірювань здійснюється відповідно до рекомендацій МІ 2335-95. ДСМ "Внутрішній контроль якості результатів кількісного хімічного аналізу".

5. Розробники

Юдіна Т.В., Федорова Н.Є. (ФНЦГ ім. Ф.Ф. Ерісмана).

Давидюк О.І. (УкрНДІГІНТОКС, м. Київ); Кісенко М.А., Демченко В.Ф. (Інститут медицини праці АН та АМН України, м. Київ).

Нормально-фазова ВЕРХ

Нерухома фаза більш полярна, ніж рухлива, тому у складі елюентів переважає неполярний розчинник:

Гексан: ізопропанол = 95:5 (для малополярних речовин)
Хлороформ:метанол = 95:5 (для середньополярних речовин)
Хлороформ:метанол = 80:20 (для сильнополярних речовин)

Обернено-фазова ВЕРХ

Звичайними елюентами для обернено-фазової ВЕРХ є:

Ацетонітрил: вода
Метанол: вода
Ізопропанол: вода

Матриці для ВЕРХ

Основні характеристики матриці:

Розмір часток (мкм);
Розмір внутрішніх пір (Å, нм).

Отримання силікагелю для ВЕРХ:

Формування мікросфер полікрем'євої кислоти;
Сушіння частинок силікагелю;
Повітряне сепарування.

Частинки сорбенту:

Регулярні (сферичні): вища стійкість до тиску, вища вартість;
Несферичні: нижча стійкість до тиску.

Щеплення нерухомої фази

Нормально-фазова ВЕРХ:

Нерухома фаза з пропілнітрильним щепленням (нітрильним);
Нерухома фаза з пропіламінним щепленням (амінною).

Зворотно-фазова ВЕРХ:

Нерухома фаза з алкільним щепленням;
Нерухома фаза з алкілсилільним щепленням.

Детектори для ВЕРХ

Ультрафіолетовий
Діодно-матричний
Флуоресцентний
Електрохімічний
Рефрактометричний
Мас-селективний

Посилання

Wikimedia Foundation. 2010 .

Дивитись що таке "Високоефективна рідинна хроматографія" в інших словниках:

Термін високоефективна рідинна хроматографія Термін англійською high performance liquid chromatography Синоніми Абревіатури ВЕРХ, HPLC Пов'язані терміни адсорбція, олігопептид, протеоміка, сорбент, фулерен, ендоедральний, хроматографія… …

Рідина хроматографія, в якій для підвищення ефективності поділу ритель (елюент) під тиском (більше 3х107 Па) прокачують через колонки, заповнені сорбентом з частинками малого діаметра (до 1 мкм), а також використовують перфузійні ...

Вид хрому тографії, в якій рухомий фазою служитьрідкість (елюент), а нерухомої та. сорбент, тб. носій із нанесеною на його поверхню рідиною або гель. Здійснюють у колонці, заповненій сорбентом (колонова хроматографія), на плоскій… Природознавство. Енциклопедичний словник

- [κρώμα (υрома) колір] процес, заснований на неоднаковій здатності окремих компонентів суміші (рідкої або газоподібної) утримуватись на поверхні адсорбенту як при поглинанні їх з потоку носія, так і при… Геологічна енциклопедія

- (від ін. грецьк... Вікіпедія

Термін хроматографія Термін англійською chromatography Синоніми Абревіатури Пов'язані терміни високоефективна рідинна хроматографія, клатрат, лабораторія на чіпі, порометрія, протеом, протеоміка, сорбент, фермент, фулерен, ендоедральний… … Енциклопедичний словник нанотехнологій

Рідина хроматографія, заснована на разл. можливості іонів, що розділяються, до іонного обміну з фіксир. іонами сорбенту, що утворюються внаслідок дисоціації іоногенних груп останнього. Для поділу катіонів використовують катіоніти, для ... Хімічна енциклопедія

ВЕРХ- високоефективна рідинна хроматографія. Словник скорочень російської мови

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) один з ефективних методів поділу складних сумішей речовин, що широко застосовується як в аналітичній хімії, так і в хімічній технології. Основою хроматографічного поділу є участь … Вікіпедія

Книги

Практична високоефективна рідинна хроматографія, Вероніка Р. Майєр. Представляємо читачеві 5-те видання книги, яке розширено за рахунок сучасних методів та обладнання. У книзі багато доопрацьовано та додано велику кількість посилань. Ті місця у тексті, де…

(ОФС 42-0096-09)

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) – це метод колонкової хроматографії, в якому рухомий фазою (ПФ) служить жид-

кістка, що рухається через хроматографічну колонку, заповнену непід-

вижною фазою (сорбентом). Колонки для ВЕРХ характеризуються високим гідравлічним тиском на вході в колонку, тому ВЕРХ іноді називають

ють «рідинною хроматографією високого тиску».

Залежно від механізму поділу речовин розрізняють таку-

щі варіанти ВЕРХ: адсорбційну, розподільчу, іонообмінну,

ексклюзивну, хіральну та ін.

В адсорбційній хроматографії поділ речовин відбувається за рахунок їх різної здатності адсорбуватися і десорбуватися з по-

верхності адсорбенту з розвиненою поверхнею, наприклад силікагелю.

У розподільчій ВЕРХ поділ відбувається за рахунок відмінності коефіцієнтів розподілу речовин, що розділяються між нерухомою

(як правило, хімічно прищепленої до поверхні нерухомого носія) та

рухомий фазами.

За полярністю ПФ і НФ ВЕРХ поділяють на нормально-фазову та об-

ращенно-фазову.

Нормально-фазовим називають варіант хроматографії, в якому вико-

користуються полярний сорбент (наприклад, силікагель або силікагель з при-

крученими NH2 - або CN-групами) і неполярна ПФ (наприклад, гексан з раз-

особистими добавками). У звернено-фазовому варіанті хроматографії вико-

використовують неполярні хімічно модифіковані сорбенти (наприклад,

неполярний алкільний радикал C18 ) і полярні рухомі фази (наприклад,

метанол, ацетонітрил).

В іонообмінній хроматографії молекули речовин суміші, дисоці-

що вали в розчині на катіони та аніони, поділяються при русі через

сорбент (катіоніт або аніоніт) за рахунок їх різної швидкості обміну з іонними

ми групами сорбенту.

В екслюзійній (ситової, гель-проникаючої, гель-фільтраційної)

хроматографії молекули речовин поділяються за розміром за рахунок їхньої різної здатності проникати в пори нерухомої фази. При цьому першими з ко-

лонки виходять найбільші молекули (з найбільшою молекулярною масою), здатні проникати в мінімальне число пір нерухомої фази,

а останніми виходять речовини з малими розмірами молекул.

Часто поділ протікає не по одному, а по кількох механізмах одночасно.

Метод ВЕРХ може застосовуватися для контролю якості будь-яких нега-

подібних аналізованих речовин. Для аналізу використовують відповідні прилади – рідинні хроматографи.

До складу рідинного хроматографа зазвичай входять такі основ-

ні вузли:

– вузол підготовки ПФ, включаючи ємність з рухомою фазою (або ємно-

сти з окремими розчинниками, що входять до складу рухомої фа-

зи) та систему дегазації ПФ;

– насосна система;

– змішувач рухомої фази (за потреби);

– система введення проби (інжектор);

– хроматографічна колонка (може бути встановлена в термостаті);

– детектор;

– система збору та обробки даних.

Насосна система

Насоси забезпечують подачу ПФ у колонку із заданою постійною швидкістю. Склад рухомої фази може бути постійним або змінюва-

ним під час аналізу. У першому випадку процес називають ізократичним,

а у другому – градієнтним. Перед насосною системою інколи встановлюють

фільтри з діаметром пір 0,45 мкм для фільтрації рухомої фази. Сучасні-

Насосна система рідинного хроматографа складається з одного або декількох насосів, керованих комп'ютером. Це дозволяє міняти зі-

ставши ПФ за певною програмою при градієнтному елююванні. Смі-

шення компонентів ПФ в змішувачі може відбуватися як при низькому тиску.

лені (до насосів), так і при високому тиску (після насосів). Змішувач можна використовувати для підготовки ПФ і при ізократичному елююванні,

однак більш точне співвідношення компонентів досягається при попередньому

ном змішуванні компонентів ПФ для ізократичного процесу. Насоси для аналітичної ВЕРХ дозволяють підтримувати постійну швидкість подачі ПФ колонку в інтервалі від 0,1 до 10 мл/хв при тиску на вході в колонку до 50 МПа. Доцільно, однак, щоб це значення не перевищувало

шало 20 МПа. Пульсації тиску мінімізуються спеціальними демп-

ферними системами, що входять до конструкції насосів. Робочі деталі на-

сосів виготовляються з корозійностійких матеріалів, що дозволяє використовувати у складі ПФ агресивні компоненти.

Змішувачі

За своєю конструкцією змішувачі можуть бути статичними або динамічними.

ними.

У змішувачі відбувається утворення єдиної рухомої фази з від-

дільних розчинників, що подаються насосами, якщо необхідна суміш не була приготовлена заздалегідь. Змішування розчинників зазвичай відбувається мимовільно, але іноді застосовуються системи з примусовим сумішшю.

шивання.

Інжектори

Інжектори можуть бути універсальними для введення проб від

1 мкл до 2 мл або дискретними для введення проби тільки певного об'єму.

ема. Обидва типи інжекторів можуть бути автоматичними (автоінжектори або автосемплери). Інжектор для введення проби (розчину) розташований не-

посередньо перед хроматографічною колонкою. Конструкція інжектора дозволяє змінювати напрямок потоку ПФ та здійснювати попереднє введення проби у петлю певного об'єму (зазвичай від 10 до 100 мкл).

Цей обсяг вказано на маркуванні петлі. Конструкція інжектора дає змогу здійснювати заміну петлі. Для введення аналізованого розчину в неав-

томатичний інжектор використовується ручний мікрошприц з об'ємом,

тельно перевершує обсяг петлі. Надлишок введеного розчину, не по-

що розміщується в петлі, скидається, і в колонку вводиться точний і завжди однаковий обсяг проби. Ручне неповне заповнення петлі знижує точ-

ність і відтворюваність дозування і, отже, погіршує точ-

ність та відтворюваність хроматографічного аналізу.

Хроматографічна колонка

Хроматографічні колонки зазвичай являють собою трубки з нержавіючої сталі, скла або пластику, заповнені сорбентом і закри-

ті з обох сторін фільтрами з діаметром пор 2-5 мкм. Довжина аналітично-

ської колонки в залежності від механізму хроматографічного поділу може перебувати в діапазоні від 5 до 60 см і більше (зазвичай вона становить

10-25 см), внутрішній діаметр - від 2 до 10 мм (зазвичай 46 мм). Колонки з внутрішнім діаметром менше 2 мм використовуються в мікроколонкової хрому.

тографії. Використовуються також капілярні колонки з внутрішнім діамет-

ром близько 0,3-0,7 мм. Колонки для препаративної хроматографії мають внутрішній діаметр 50 мм і більше.

Перед аналітичною колонкою можуть встановлюватися короткі ко-

лонки (предколонки) виконують різні допоміжні функції

(Чаще - захист аналітичної колонки). Зазвичай аналіз проводять при ком-

натній температурі, проте для збільшення ефективності поділу і со-

покращення тривалості аналізу може бути використане термоста-

вання колонок при температурах не вище 60 С. При більш високих температурах можлива деструкція сорбенту та зміна складу ПФ.

Нерухома фаза (сорбент)

Як сорбенти зазвичай застосовуються:

1. Силікагель, оксид алюмінію, пористий графіт використовуються в нор-

мально-фазової хроматографії. Механізм утримування в даному слу-

чаї - зазвичай адсорбція;

2. Смоли або полімери з кислотними чи основними групами. Область застосування – іонообмінна хроматографія;

3. Пористий силікагель або полімери (ексклюзивна хроматографія);

4. Хімічно модифіковані сорбенти (сорбенти з щепленими фа-

зами), приготовані найчастіше на основі силікагелю. Механізм утримування в більшості випадків - розподіл між рухомих-

ної та нерухомої фазами;

5. Хімічно модифіковані хіральні сорбенти, наприклад вироб-

водні целюлози та амілози, протеїни та пептиди, циклодекстрини,

використовуються для поділу енантіомерів (хіральна хроматогра-

Сорбенти з щепленими фазами можуть мати різний ступінь хімі-

чеської модифікації. Частинки сорбенту можуть мати сферичну або не-

правильну форму та різноманітну пористість.

Як щеплені фази найчастіше застосовуються:

– октильні групи(сорбент октилсилан або С8);

– октадецільні групи(Сорбент октадецилсилан

(ODS) або С18);

– фенільні групи(Сорбент фенілсилан);

– ціанопропільні групи(Сорбент CN);

– амінопропильні групи(сорбент NH2);

- Діольні групи (сорбент діол).

Найчастіше аналіз виконують на неполярних щеплених фазах

звернено-фазовому режимі із застосуванням сорбенту С18 .

У деяких випадках доцільніше застосовувати нормально-

фазову хроматографію При цьому використовують силікагель або полярні щеплені фази (CN, NH2, діол) в поєднанні з неполярними розчинами.

Сорбенти з щепленими фазами хімічно стійкі при значеннях pH від 2,0 до 8,0, якщо інше не обумовлюється виробником.

Частинки сорбенту можуть мати сферичну або неправильну форму та різноманітну пористість. Розмір частинок сорбенту в аналітичній ВЕРХ зазвичай становить 3-10 мкм, препаративної ВЕРХ - до 50 мкм і більше.

Використовуються також монолітні сорбенти.

Висока ефективність поділу забезпечується високою площею поверхні частинок сорбенту (яка є наслідком їх мікроскопії).

чних розмірів та наявності пір), а також рівномірністю складу сорбенту і щільною та рівномірною його упаковкою.

Детектори

Використовуються різні способи детектування. У загальному випадку ПФ з розчиненими в ній компонентами після хроматографічної колон-

ки потрапляє в комірку детектора, де безперервно вимірюється та чи інша її властивість (поглинання в УФ або видимій області спектру, флуоресценція,

показник заломлення, електропровідність та ін.). Отримана при цьому хроматограма являє собою графік залежності деякого фізичного характеру.

ського чи фізико-хімічного параметра ПФ від часу.

Найбільш поширеними є спектрофотометричні де-

тектори (включаючи діодно-матричні), що реєструють зміну опти-

ської щільності в ультрафіолетовій, видимій і часто в ближній інфрачервоній

ній областях спектру від 190 до 800 або 900 нм. Хроматограма в цьому слу-

чає є залежність оптичної щільності ПФ від часу.

Традиційно використовуваний спектрофотометричний детектор дозволяє

ляє проводити детектування при будь-якій довжині хвилі в його робочому діапі-

зоні. Застосовуються також мультихвильові детектори, що дозволяють прово-

діти детектування за кількох довжинах хвиль одночасно.

За допомогою діодно-матричного детектора можна не тільки проводити детектування відразу по кількох довжинах хвиль, а й практично миттєво

венно (без сканування) отримувати оптичний спектр ПФ в будь-який момент часу, що значно спрощує якісний аналіз ком-

понентів.

Чутливість флуоресцентних детекторів приблизно в 1000 разів вища за чутливість спектрофотометричних. При цьому використовується або власна флуоресценція, або флуоресценція відповідних похідних, якщо сама речовина не флуоресціює. Сучасні-

менні флуоресцентні детектори дозволяють не тільки отримувати хромато-

грами, але і реєструвати спектри збудження та флуоресценції аналі-

зованих з'єднань.

Для аналізу зразків, що не поглинають в УФ та видимій областях спектру (наприклад, вуглеводів), використовують рефрактометричні детектори

(Рефрактометри). Недоліки цих детекторів – їх низька (порівняно зі спектрофотометричними детекторами) чутливість та значна температурна залежність інтенсивності сигналу (детектор необхідно термостатувати).

Використовуються також електрохімічні детектори (кондуктометричні

ські, амперометричні та ін), мас-спектрометричні та Фур'є-ІК-

детектори, детектори світлорозсіювання, радіоактивності та деякі інші

Рухома фаза

У Як ПФ можуть застосовуватися різноманітні розчинники - як індивідуальні, так і їх суміші.

У нормально-фазовийхроматографії зазвичай застосовуються рідкі уг-

лівороди (гексан, циклогексан, гептан) та інші відносно неполярні

розчинники з невеликими добавками полярних органічних сполук,

які регулюють елюювальну силу ПФ.

У звернено-фазовій хроматографії до складу ПФ входять полярні ор-

ганічні розчинники (зазвичай ацетонітрил та метанол) та вода. Для опти-

мізації поділу часто використовують водні розчини з певним зна-

ченням рН, зокрема буферні розчини. Застосовують добавки неоргані-

тичних та органічних кислот, основ і солей та інші сполуки (на-

приклад, хіральні модифікатори для поділу енантіомерів на ахіраль-

ном сорбенті).

Контроль значення рН необхідно здійснювати окремо для водного компоненту, а не для його суміші з органічним розчинником.

ПФ може складатися з одного розчинника, часто з двох, при необхо-

димості – із трьох і більше. Склад ПФ вказують як об'ємне співвідношення розчинників, що входять до неї. В окремих випадках може вказуватися мас-

сове співвідношення, що має бути спеціально обумовлено.

При використанні ультрафіолетового спектрофотометричного детектора ПФ не повинна мати вираженого поглинання при вибраній для детектування довжині хвилі. Межа прозорості або оптична щільність при визна-

ної довжині хвилі розчинника конкретного виробника часто вказують

ється на упаковці.

На хроматографічний аналіз великий вплив надає ступінь чистоти ПФ, тому переважно застосовувати розчинники,

ні спеціально для рідинної хроматографії (включаючи воду).

ПФ і аналізовані розчини не повинні містити нерозчинних-

ся частинок та бульбашок газу. Воду, одержану в лабораторних умовах,

водні розчини, попередньо змішані з водою органічні розчини.

рітелі, а також аналізовані розчини необхідно піддавати тонкій фільтрації та дегазації. Для цих цілей зазвичай застосовують фільтрування

під вакуумом через інертний по відношенню до даного розчинника або розчину мембранний фільтр з розміром пор 0,45 мкм.

Система збору та обробки даних

Сучасна система обробки даних являє собою сполуч-

дружинний з хроматографом персональний комп'ютер із встановленим про-

грамним забезпеченням, що дозволяє реєструвати та обробляти хро-

матограму, а також керувати роботою хроматографа і стежити за основною

ними параметрами хроматографічної системи.

Перелік умов хроматографування, що підлягають вказівці

У приватній фармакопейній статті мають бути наведені розміри ко-

лонки, тип сорбенту із зазначенням розміру частинок, температура колонки (якщо необхідне термостатування), обсяг проби, що вводиться (обсяг петлі), со-

ставши ПФ і спосіб її приготування, швидкість подачі ПФ, детектор і умови детектування, опис градієнтного режиму (якщо використовується), час хроматографування.

ІОНООБМІННА ТА ІОННА ВЕРХ

Іонообмінна хроматографія використовується для аналізу як органічно-

ських (гетероциклічні основи, амінокислоти, білки та ін), так і неор-

ганічних (різні катіони та аніони) сполук. Поділ компо-

нентов аналізованої суміші в іонообмінній хроматографії засновано на оборотній взаємодії іонів аналізованих речовин з іонними групами.

пами сорбенту. Як сорбенти використовуються аніоніти або катіоні-

ти. Ці сорбенти є, в основному, або полімерні іоно-

обмінні смоли (зазвичай кополімери стиролу та дивінілбензолу з приві-

іонними групами), або силікагелі з щепленими іонообмінними групами. Сорбенти із групами -(СН2 )3 N+ Х– використовуються для поділу аніонів, а сорбенти із групами -(СН2 )SО3 – Н+ – для поділу катіонів.

Зазвичай для поділу аніонів застосовують полімерні смоли, а для розд -

лення катіонів - модифіковані силікагелі.

Як ПФ в іонообмінній хроматографії застосовують водні розчини кислот, основ та солей. Зазвичай використовуються буферні рас-

твори, що дозволяють підтримувати певні значення рН. Можливе також використання невеликих добавок, що змішуються з водою органічно.

ських розчинників - ацетонітрилу, метанолу, етанолу, тетрагідрофурану.

Іонна хроматографія- варіант іонообмінної хроматографії,

якому для визначення концентрації іонів аналізованої речовини ви-

користується кондуктометричний детектор. Для високочутливого оп-

редіння змін електропровідності проходить через детектор ПФ фонова електропровідність ПФ повинна бути низькою.

Існують два основні варіанти іонної хроматографії.

Перший з них заснований на придушенні електропровідності електролі-

та ПФ за допомогою другої іонообмінної колонки, що знаходиться між ана-

літичною колонкою та детектором. У цій колонці відбувається нейтраліз-

ція ПФ і аналізовані сполуки потрапляють в комірку детектора в деіоні-

ній воді. Детектовані іони є єдиними іонами,

що забезпечують провідність ПФ. Недолік переважної колонки – необхідність її регенерації через досить короткі проміжки часу.

Мені. Переважна колонка може бути замінена безперервно дію-

щим мембранним подавлювачем, в якому склад мембрани безперервно про-

новлюється потоком регенеруючого розчину, що рухається в напрямку,

протилежному напрямку потоку ПФ.

Другий варіант іонної хроматографії – одноколоночна іонна хроматографія.

матографія. У цьому варіанті використовується ПФ з дуже низькою електропро-

водністю. В якості електролітів широко застосовують слабкі органічні

ські кислоти - бензойну, саліцилову або ізофталеву.

ЕКСКЛЮЗІЙНА ВЕРХ

Ексклюзивна хроматографія (гель-хроматографія) - особливий варіант ВЕРХ, заснований на розподілі молекул за їх розмірами. Розподіл

молекул між нерухомою та рухомою фазами засновано на розмірах мо-

лекул та частково на їх формі та полярності. Для поділу використовують по-

ристі сорбенти – полімери, силікагель, пористі стекла та полісахариди.

Розмір частинок сорбентів 5-10 мкм.

Перевагами пористого скла та силікагелю є швидка дифузія ПФ та молекул аналізованої речовини в пори, стійкість у різних умовах (навіть за високих температур). Полімерні сорбен-

ти є сополімерами стиролу і дивінілбензолу (це гідро-

фобні сорбенти, що використовуються з неполярними рухомими фазами) та

гідрофільні гелі, одержувані із сульфованого дивінілбензолу або поліакриламідних смол.

Можливі два граничні типи взаємодії молекул з пористою нерухомою фазою. Молекули, розмір яких більший за середній діаметр а пор, взагалі не проникають в сорбент і елююються разом з рухомою фа-

зою першими. Молекули з діаметром значно менше розміру пор сор-

бента вільно проникають у нього, залишаються у нерухомій фазі найбільший час і елююються останніми. Молекули середніх розмірів проникають у пори сорбенту в залежності від розміру та частково в залежності від своєї форми. Вони елююються з різними часами утримування між са-

ними великими і найдрібнішими молекулами. Поділ компонентів хроматографованого зразка відбувається в результаті повторюваних ак-

тов дифузії компонентів зразка в пори сорбенту, і назад.

В эксклюзивної хроматографії для характеристики утримування вико-

користується обсяг утримування, що дорівнює добутку швидкості потоку ПФ на час утримування.

Рухлива фаза. Вибір ПФ залежить від типу сорбенту. Ексклюзив-

ная хроматографія в цілому ділиться на гель-фільтраційну та гель-

проникаючу хроматографію.

Метод гель-фільтраційної хроматографії використовують для розділу

ня водорозчинних сполук на гідрофільних сорбентах. Рухливі фази є водні буферні розчини із заданим значенням рН.

У гель-проникаючій хроматографії застосовуються гідрофобні сор-

бенти та неполярні органічні розчинники (толуол, дихлорметан, тет-

рагідрофуран). Цей метод використовують для аналізу сполук, малорос-

римих у воді.

детектори. В якості детекторів в хроматографії ексклюзійної використовуються диференціальні рефрактометричні детектори, а також спектрофотометричні детектори (в тому числі, в ІЧ-області спектру).

Застосовуються також віскозиметричний та проточний лазерний детектори.

Ці детектори в комбінації з рефрактометром або іншим концентра-

ним детектором дозволяють безперервно визначати молекулярну масу по-

лімеру в ПФ.

УЛЬТРАЕФЕКТИВНА РІДИНА ХРОМАТОГРАФІЯ

Ультраефективна рідинна хроматографія являє собою варіант рідинної хроматографії, що відрізняється більшою ефективно-

ністю порівняно з класичною ВЕРХ.

Особливістю ультраефективної рідинної хроматографії є

ся використання сорбентів з розміром частинок від 1,5 до 2 мкм. Розміри хро-

матографічних колонок зазвичай становлять від 50 до 150 мм у довжину та від 1

до 4 мм у діаметрі. Об'єм проби, що вводиться, може становити від 1 до 50 мкл.

Хроматографічне обладнання, що використовується в класичному ва-