cromatografía líquida. Características del uso del método de cromatografía líquida de alta resolución en productos farmacéuticos. Esencia del método de cromatografía líquida.

(principalmente intermolecular) en la interfase. Como método de análisis, la HPLC forma parte de un grupo de métodos que, debido a la complejidad de los objetos en estudio, incluye la separación preliminar de la mezcla compleja inicial en otras relativamente simples. Las mezclas simples obtenidas se analizan luego por métodos fisicoquímicos convencionales o por métodos especiales desarrollados para la cromatografía.

El método HPLC se usa ampliamente en campos como la química, la petroquímica, la biología, la biotecnología, la medicina, el procesamiento de alimentos, la protección del medio ambiente, la producción de medicamentos y muchos otros.

Según el mecanismo de separación de las sustancias analizadas o separadas, la HPLC se divide en adsorción, distribución, intercambio iónico, exclusión, intercambio de ligandos y otros.

Debe tenerse en cuenta que en el trabajo práctico, la separación a menudo se produce no por uno, sino por varios mecanismos simultáneamente. Por lo tanto, la separación por exclusión puede complicarse por los efectos de adsorción, adsorción - distribución y viceversa. Al mismo tiempo, cuanto mayor sea la diferencia de sustancias en la muestra en términos de grado de ionización, basicidad o acidez, en términos de peso molecular, polarizabilidad y otros parámetros, más probable es que aparezca un mecanismo de separación diferente. para tales sustancias.

HPLC en fase normal

La fase estacionaria es más polar que la fase móvil, por lo que el disolvente no polar predomina en la composición del eluyente:

Hexano:isopropanol = 95:5 (para sustancias poco polares)
Cloroformo:metanol = 95:5 (para sustancias polares medias)
Cloroformo:metanol = 80:20 (para sustancias altamente polares)

HPLC de fase inversa

La fase estacionaria es menos polar que la fase móvil, por lo que casi siempre hay agua en el eluyente. En este caso, siempre es posible asegurar la disolución completa del BAS en la fase móvil, casi siempre es posible usar la detección UV, casi todas las fases móviles son miscibles entre sí, se puede usar la elución en gradiente, la columna se puede volver a colocar rápidamente -equilibrada, la columna se puede regenerar.

Los eluyentes comunes para HPLC de fase inversa son:

Acetonitrilo: agua
metanol: agua
Isopropanol: agua

Matrices para HPLC

Las matrices utilizadas en HPLC son compuestos inorgánicos como sílice (gel de sílice) o alúmina, o polímeros orgánicos como poliestireno (reticulado con divinilbenceno) o polimetacrilato. El gel de sílice es, por supuesto, ahora generalmente aceptado.

Las principales características de la matriz:

Tamaño de partícula (µm);
Tamaño de poro interno (Å, nm).

Obtención de gel de sílice para HPLC:

Formación de microesferas de ácido polisilícico;
Secado de partículas de gel de sílice;
Separación de aire.

Partículas absorbentes:

Regular (esférica): mayor resistencia a la presión, mayor costo;
No esférica: menor resistencia a la presión.

El tamaño de poro en HPLC es uno de los parámetros más importantes. Cuanto menor sea el tamaño de los poros, peor será su permeabilidad para las moléculas de las sustancias eluidas. Y en consecuencia, peor será la capacidad de sorción de los adsorbentes. Cuanto más grandes son los poros, menor es, en primer lugar, la estabilidad mecánica de las partículas adsorbentes y, en segundo lugar, cuanto menor es la superficie de sorción, por lo tanto, peor es la eficiencia.

Injertos de fase estacionaria

HPLC en fase normal:

Fase estacionaria injertada con propilnitrilo (nitrilo);
Fase estacionaria con injerto de propilamina (amina).

HPLC de fase inversa:

Fase estacionaria con injerto de alquilo;
Fase estacionaria con injerto de alquilsililo.

Recubrimiento final: protección de áreas no injertadas del sorbente mediante injertos adicionales con moléculas "pequeñas". Protección terminal hidrofóbica (C1, C2): mayor selectividad, peor humectabilidad; protección terminal hidrófila (diol): menor selectividad, mayor humectabilidad.

detectores de HPLC

ultravioleta
matriz de diodos
Fluorescente
electroquímico
refractométrico
selectivo de masas

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Práctica de cromatografía líquida de alta resolución, Veronica R. Mayer. Presentamos al lector la 5ª edición del libro, que se ha ampliado con métodos y equipos modernos. Se ha mejorado mucho en el libro y se ha añadido un gran número de referencias. Los lugares del texto donde...

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un método de cromatografía en columna en el que la fase móvil (MP) es un líquido que se mueve a través de una columna cromatográfica llena de una fase estacionaria (sorbente). Las columnas de HPLC se caracterizan por una alta presión hidráulica en la entrada de la columna, por lo que a veces se hace referencia a la HPLC como "cromatografía líquida de alta presión".

Según el mecanismo de separación de sustancias, se distinguen las siguientes variantes de HPLC: adsorción, distribución, intercambio iónico, exclusión, quiral, etc.

En la cromatografía de adsorción, la separación de sustancias ocurre debido a su diferente capacidad para ser adsorbidas y desorbidas de la superficie de un adsorbente con una superficie desarrollada, por ejemplo, gel de sílice.

En HPLC de partición, la separación se produce debido a la diferencia en los coeficientes de distribución de las sustancias a separar entre las fases estacionaria (por regla general, químicamente injertadas en la superficie de un soporte estacionario) y móvil.

Por polaridad, PF y NF HPLC se dividen en fase normal y fase inversa.

La cromatografía de fase normal es una variante de la cromatografía que utiliza un sorbente polar (por ejemplo, gel de sílice o gel de sílice con grupos NH 2 o CN injertados) y PF no polar (por ejemplo, hexano con varios aditivos). En la cromatografía de fase inversa, se utilizan absorbentes modificados químicamente no polares (p. ej., radical alquilo C18 no polar) y fases móviles polares (p. ej., metanol, acetonitrilo).

En la cromatografía de intercambio iónico, las moléculas de las sustancias de la mezcla, disociadas en solución en cationes y aniones, se separan al moverse a través del adsorbente (intercambiador catiónico o intercambiador de aniones) debido a sus diferentes tasas de intercambio con los grupos iónicos del adsorbente. .

En la cromatografía de exclusión por tamaño (tamiz, penetración en gel, filtración en gel), las moléculas de las sustancias se separan por tamaño debido a su diferente capacidad para penetrar en los poros de la fase estacionaria. En este caso, las moléculas más grandes (con mayor peso molecular) capaces de penetrar en el mínimo número de poros de la fase estacionaria son las primeras en salir de la columna, y las sustancias de pequeño tamaño molecular son las últimas en salir.

a menudo la separación procede no por uno, sino por varios mecanismos simultáneamente.

El método HPLC se puede utilizar para el control de calidad de cualquier analito no gaseoso. Para el análisis, se utilizan instrumentos apropiados: cromatógrafos líquidos.

La composición de un cromatógrafo de líquidos suele incluir los siguientes componentes principales:

– una unidad de preparación de FP, que incluye un tanque con una fase móvil (o tanques con solventes individuales que forman parte de la fase móvil) y un sistema de desgasificación de FP;

– sistema de bombeo;

– mezclador de fase móvil (si es necesario);

– sistema de inyección de muestra (inyector);

– columna cromatográfica (se puede instalar en un termostato);

– detector;

– sistema de recopilación y procesamiento de datos.

Sistema de bombeo

Las bombas suministran el PF a la columna a una tasa constante dada. La composición de la fase móvil puede ser constante o cambiar durante el análisis. En el primer caso, el proceso se llama isocrático, y en el segundo, gradiente. A veces se instalan filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm antes del sistema de bombeo para filtrar la fase móvil. Un sistema de bombeo de cromatografía de líquidos moderno consta de una o más bombas controladas por computadora. Esto le permite cambiar la composición del PF según un programa específico durante la elución en gradiente. La mezcla de componentes PF en el mezclador puede ocurrir tanto a baja presión (antes de las bombas) como a alta presión (después de las bombas). El mezclador se puede utilizar para la preparación de PF y para la elución isocrática; sin embargo, se logra una relación de componentes más precisa mezclando previamente los componentes de PF para el proceso isocrático. Las bombas HPLC analíticas permiten mantener un caudal constante de PF en la columna en el rango de 0,1 a 10 ml/min a una presión de entrada de columna de hasta 50 MPa. Sin embargo, es aconsejable que este valor no supere los 20 MPa. Las pulsaciones de presión se minimizan mediante sistemas amortiguadores especiales incluidos en el diseño de las bombas. Las partes de trabajo de las bombas están hechas de materiales resistentes a la corrosión, lo que permite el uso de componentes agresivos en la composición del PF.

"Cromatografía líquida de alta resolución de contaminantes naturales y de aguas residuales"

Introducción

Capítulo 1. Conceptos básicos y clasificación de los métodos de cromatografía líquida

1.1 Aparatos para cromatografía líquida

Capítulo 2. La esencia de HPLC

2.1 Aplicación

Capítulo 3. Ejemplos de uso de HPLC en el análisis de objetos ambientales

Capítulo 4 Instrumentación de HPLC

Literatura

Apéndice

Introducción

Métodos cromatográficos son a menudo indispensables para la identificación y cuantificación de compuestos orgánicos con una estructura similar. Los más utilizados para el análisis rutinario de contaminantes ambientales son la cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta resolución. El análisis por cromatografía de gases de contaminantes orgánicos en aguas potables y residuales se basó inicialmente en el uso de columnas empaquetadas, más tarde también se generalizaron las columnas capilares de cuarzo. El diámetro interno de las columnas capilares suele ser de 0,20-0,75 mm, longitud - 30-105 m Los resultados óptimos en el análisis de contaminantes en el agua se logran con mayor frecuencia cuando se utilizan columnas capilares con diferentes espesores de película hechas de siliconas de metilfenilo con un contenido de fenilo. grupos de 5 y 50% . El sistema de inyección de muestras a menudo se convierte en un punto vulnerable en las técnicas cromatográficas que utilizan columnas capilares. Los sistemas de inyección de muestras se pueden dividir en dos grupos: universales y selectivos. Los universales incluyen sistemas de inyección con y sin desdoblamiento del caudal, inyección “fría” en columna y evaporación con programación de temperatura. La inyección selectiva utiliza purga con captura intermedia, análisis de espacio de cabeza, etc. Cuando se utilizan sistemas de inyección universal, toda la muestra ingresa a la columna, con inyección selectiva, solo se introduce una fracción determinada. Los resultados obtenidos con la inyección selectiva son significativamente más precisos, ya que la fracción que ingresa a la columna contiene solo sustancias volátiles, y la técnica puede automatizarse por completo.

Los detectores cromatográficos de gases utilizados en el control de contaminantes se dividen a menudo en detectores universales, que responden a cada componente de la fase móvil, y detectores selectivos, que reaccionan ante la presencia de un determinado grupo de sustancias con características químicas similares en la fase móvil. Los universales incluyen ionización de llama, emisión atómica, detectores espectrométricos de masas y espectrometría infrarroja. Los detectores selectivos utilizados en el análisis del agua son de captura de electrones (selectivo para sustancias que contienen átomos de halógeno), termoiónico (selectivo para compuestos que contienen nitrógeno y fósforo), fotoionización (selectivo para hidrocarburos aromáticos), detector de conductividad electrolítica (selectivo para compuestos que contienen halógeno). , átomos de azufre y nitrógeno). Las cantidades mínimas detectables de sustancias oscilan entre nanogramos y picogramos por segundo.

Cromatografía líquida de alta resolución(HPLC) es un método ideal para la determinación de un gran número de compuestos térmicamente inestables que no pueden analizarse mediante cromatografía de gases. Actualmente, los agroquímicos modernos, incluidos los carbonatos de metilo y los insecticidas organofosforados, y otras sustancias no volátiles, a menudo se convierten en objetos de análisis por cromatografía líquida. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) está ganando terreno entre otros métodos utilizados en el monitoreo ambiental, también porque tiene grandes perspectivas en términos de automatización de la preparación de muestras.

CAPÍTULO 1. CONCEPTOS BÁSICOS Y CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

La cromatografía líquida se divide en varias clases según el tipo de soporte de fase estacionaria. La instrumentación simple del papel y la cromatografía en capa fina llevó al uso generalizado de estos métodos en la práctica analítica. Sin embargo, las grandes posibilidades de la cromatografía líquida en columna estimularon la mejora de los equipos para este método clásico y condujeron a la rápida introducción de la HPLC. Pasar el eluyente a través de la columna a alta presión hizo posible aumentar considerablemente la tasa de análisis y aumentar significativamente la eficiencia de separación debido al uso de un adsorbente finamente disperso. El método HPLC actualmente permite aislar, analizar cuantitativa y cualitativamente mezclas complejas de compuestos orgánicos.

Según el mecanismo de interacción de la sustancia separada (eluido) con la fase estacionaria, se distinguen la adsorción, la distribución, el intercambio iónico, la exclusión por tamaño, el par iónico, el intercambio de ligando y la cromatografía de afinidad.

Cromatografía de adsorción. La separación por cromatografía de adsorción se lleva a cabo como resultado de la interacción de la sustancia a separar con un adsorbente, como el óxido de aluminio o el gel de sílice, que tienen centros polares activos en la superficie. El solvente (eluyente) es un líquido no polar. El mecanismo de sorción consiste en una interacción específica entre la superficie polar del adsorbente y las regiones polares (o susceptibles de ser polarizadas) de las moléculas del componente analizado (Fig. 1).

Arroz. 1. Cromatografía líquida de adsorción.

cromatografía de partición. En la versión distributiva de la cromatografía líquida, la separación de una mezcla de sustancias se lleva a cabo debido a la diferencia en sus coeficientes de distribución entre dos fases inmiscibles: el eluyente (fase móvil) y la fase ubicada en el adsorbente (fase estacionaria).

En fase normal La cromatografía líquida de partición utiliza un eluyente no polar y grupos polares injertados en la superficie de un adsorbente (generalmente gel de sílice). Los alquilclorosilanos sustituidos que contienen grupos polares, como nitrilo, grupo amino, etc., se utilizan como modificadores de la superficie del gel de sílice (fases unidas) (Fig. 2). El uso de fases ligadas permite controlar con precisión las propiedades de sorción de la superficie de la fase estacionaria y lograr una alta eficiencia de separación.

Arroz. 2. Cromatografía de partición con fase ligada (variante de fase normal).

fase inversa la cromatografía líquida se basa en la distribución de los componentes de la mezcla entre el eluyente polar y los grupos no polares (cadenas alquílicas largas) injertados en la superficie del sorbente (Fig. 3).

Arroz. 3. Cromatografía de partición con fase ligada (versión de fase reversa).

Menos utilizada es una variante de la cromatografía líquida soportada, en la que se aplica una fase estacionaria líquida a un soporte estacionario.

Exclusivo (gel penetrante) La cromatografía es una variante de la cromatografía líquida en la que la separación de sustancias ocurre debido a la distribución de moléculas entre el solvente ubicado en los poros del adsorbente y el solvente que fluye entre sus partículas.

afín La cromatografía se basa en interacciones específicas de proteínas separadas (anticuerpos) con sustancias (antígenos) injertadas en la superficie de un sorbente (resina sintética) que forma selectivamente complejos (conjugados) con proteínas.

La cromatografía de intercambio de iones, de pares de iones y de intercambio de ligandos se utiliza principalmente en el análisis inorgánico.

Parámetros básicos de la separación cromatográfica.

Los principales parámetros de la separación cromatográfica son el volumen de retención y el tiempo de retención del componente de la mezcla (Fig. 4).

El tiempo de retención tR es el tiempo transcurrido desde que se inyecta la muestra en la columna hasta que se alcanza el máximo del pico correspondiente. Multiplicando el tiempo de retención por la velocidad del volumen de eluyente F, obtenemos el volumen de retención VR:

El tiempo de retención corregido es el tiempo transcurrido desde que aparece el pico del componente no absorbible hasta el pico del compuesto correspondiente:

tR" = tR - t0 ;

El volumen de retención normalizado o corregido es el volumen de retención corregido por el volumen muerto de la columna V0, es decir, el volumen de retención del componente no absorbible:

VR" = VR - V0;

La característica de retención es también el factor de capacitancia k", definido como la relación entre la masa de la sustancia en la fase estacionaria y la masa de la sustancia en la fase móvil: k" = mn / mp;

El valor de k" es fácil de determinar a partir del cromatograma:

Los parámetros más importantes de la separación cromatográfica son su eficiencia y selectividad.

La eficiencia de la columna, medida por la altura de los platos teóricos (HETP) e inversamente proporcional a su número (N), es mayor cuanto más estrecho es el pico de la sustancia que emerge en el mismo tiempo de retención. El valor de eficiencia se puede calcular a partir del cromatograma utilizando la siguiente fórmula:

N = 5,54. (tR / 1/2) 2 ,

donde tr- tiempo de espera,

w 1/2 - ancho de pico a media altura

Conociendo el número de platos teóricos por columna, la longitud de la columna L y el diámetro medio del grano de adsorbente dc, es fácil obtener los valores de la altura equivalente del plato teórico (HETP) y la altura reducida (PETP):

HETP = L/N PHETP = HETP/d c

Estas características permiten comparar la eficiencia de columnas de diferentes tipos, evaluar la calidad del adsorbente y la calidad del llenado de las columnas.

La selectividad de la separación de dos sustancias está determinada por la ecuación:

Al considerar la separación de una mezcla de dos componentes, el grado de separación RS también es un parámetro importante:

;

Los picos se consideran resueltos si el valor de RS es mayor o igual a 1,5.

Los principales parámetros cromatográficos relacionan la siguiente ecuación para la resolución:

;

Los factores que determinan la selectividad de separación son:

1) la naturaleza química del adsorbente;

2) la composición del solvente y sus modificadores;

3) estructura química y propiedades de los componentes de la mezcla a separar;

4) temperatura de la columna

1.1 Aparatos para cromatografía líquida

En la cromatografía líquida moderna, se utilizan instrumentos de diversos grados de complejidad, desde los sistemas más simples hasta cromatógrafos de alta gama equipados con varios dispositivos adicionales.

En la fig. La Figura 4 muestra un diagrama de bloques de un cromatógrafo de líquidos que contiene el conjunto mínimo requerido de componentes, de una forma u otra, presentes en cualquier sistema cromatográfico.

Arroz. 4. Diagrama de bloques de un cromatógrafo de líquidos.

La bomba (2) está diseñada para crear un flujo de disolvente constante. Su diseño está determinado principalmente por la presión de operación en el sistema. Para operar en el rango de 10-500 MPa, se utilizan bombas de émbolo (jeringa) o de pistón. La desventaja de la primera es la necesidad de paradas periódicas para el llenado con eluyente, y la segunda es la gran complejidad del diseño y, en consecuencia, el alto precio. Para sistemas simples con presiones de funcionamiento bajas de 1-5 MPa, se utilizan con éxito bombas peristálticas económicas, pero dado que es difícil lograr una presión y un caudal constantes, su uso se limita a tareas preparatorias.

El inyector (3) asegura que se inyecta en la columna una muestra de la mezcla de componentes separados con una reproducibilidad suficientemente alta. Los sistemas simples de inyección de muestra de "flujo detenido" requieren que la bomba se detenga y, por lo tanto, son menos convenientes que las pipetas de bucle de Reodyne.

Las columnas de HPLC (4) son tubos de acero inoxidable de paredes gruesas capaces de soportar altas presiones. La densidad y la uniformidad del relleno de la columna con un sorbente juegan un papel importante. Para la cromatografía de líquidos a baja presión, se utilizan con éxito columnas de vidrio de paredes gruesas. La constancia de la temperatura está asegurada por el termostato (5).

Los detectores (6) para cromatografía líquida tienen una celda de flujo en la que se mide continuamente alguna propiedad del eluyente que fluye. Los tipos más populares de detectores de propósito general son los refractómetros, que miden el índice de refracción, y los detectores espectrofotométricos, que miden la absorbancia de un solvente a una longitud de onda fija (generalmente en la región ultravioleta). Las ventajas de los refractómetros (y las desventajas de los espectrofotómetros) incluyen una baja sensibilidad al tipo de compuesto que se determina, que puede no contener grupos cromóforos. Por otro lado, el uso de refractómetros está limitado a sistemas isocráticos (con composición de eluyente constante), por lo que el uso de un gradiente de disolvente no es posible en este caso.

Las columnas de HPLC, que se utilizan con mayor frecuencia en el análisis de contaminantes ambientales, tienen una longitud de 25 cm y un diámetro interior de 4,6 mm y están llenas de partículas de gel de sílice esféricas de 5-10 µm injertadas con grupos octadecil. En los últimos años han aparecido columnas con diámetros internos más pequeños llenas de partículas más pequeñas. El uso de tales columnas reduce el consumo de solventes y la duración del análisis, aumenta la sensibilidad y la eficiencia de separación, y también facilita el problema de conectar las columnas a los detectores espectrales. Las columnas con un diámetro interno de 3,1 mm están equipadas con un cartucho de seguridad (precolumna) para aumentar la vida útil y mejorar la reproducibilidad de los análisis.

Como detectores en los instrumentos modernos de HPLC, generalmente se utilizan un detector UV en una matriz de diodos, fluorescencia y detectores electroquímicos.

Debe tenerse en cuenta que en el trabajo práctico, la separación a menudo se produce no por uno, sino por varios mecanismos simultáneamente. Por lo tanto, la separación por exclusión puede complicarse por los efectos de adsorción, adsorción - distribución y viceversa. En este caso, cuanto mayor sea la diferencia en las sustancias de la muestra en términos del grado de ionización, basicidad o acidez, en términos de peso molecular, polarizabilidad y otros parámetros, mayor será la probabilidad de un mecanismo de separación diferente para dichas sustancias. .

En la práctica, la cromatografía de "fase reversa" (partición), en la que la fase estacionaria no es polar, pero la fase móvil es polar (es decir, el reverso de la cromatografía de "fase directa"), se ha generalizado más.

En la mayoría de los laboratorios del mundo, se analiza un grupo de 16 HAP prioritarios mediante HPLC o CMS.

CAPÍTULO 2. ESENCIA DE LA HPLC

En la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la naturaleza de los procesos que ocurren en la columna cromatográfica es generalmente idéntica a los procesos en la cromatografía de gases. La diferencia está solo en el uso de un líquido como fase estacionaria. Debido a la alta densidad de las fases móviles líquidas y la alta resistencia de las columnas, la cromatografía de gases y líquidos difiere mucho en la instrumentación.

En la HPLC se suelen utilizar disolventes puros o sus mezclas como fases móviles.

Para crear una corriente de disolvente puro (o mezclas de disolventes), denominada eluyente en cromatografía líquida, se utilizan bombas, que forman parte del sistema hidráulico del cromatógrafo.

La cromatografía de adsorción se lleva a cabo como resultado de la interacción de una sustancia con adsorbentes, como gel de sílice u óxido de aluminio, que tienen centros activos en la superficie. La diferencia en la capacidad de interactuar con los centros de adsorción de diferentes moléculas de muestra conduce a su separación en zonas en el proceso de movimiento con la fase móvil a través de la columna. La división de las zonas de los componentes lograda en este caso depende de la interacción tanto con el solvente como con el adsorbente.

Los adsorbentes de gel de sílice con diferentes volúmenes, superficies y diámetros de poro encuentran la mayor aplicación en HPLC. El óxido de aluminio y otros adsorbentes se usan con mucha menos frecuencia. La razón principal de esto:

Resistencia mecánica insuficiente, que no permite el envasado y uso a presiones elevadas típicas de HPLC;

el gel de sílice en comparación con el óxido de aluminio tiene un rango más amplio de porosidad, superficie y diámetro de poro; una actividad catalítica significativamente mayor del óxido de aluminio conduce a una distorsión de los resultados del análisis debido a la descomposición de los componentes de la muestra o su quimisorción irreversible.

detectores de HPLC

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utiliza para detectar sustancias polares no volátiles que, por alguna razón, no se pueden convertir en una forma conveniente para la cromatografía de gases, incluso en forma de derivados. Tales sustancias, en particular, incluyen ácidos sulfónicos, tintes solubles en agua y algunos pesticidas, como derivados de fenilurea.

Detectores:

UV - detector de matriz de diodos. La "matriz" de fotodiodos (hay más de doscientos) registra constantemente señales en la región UV y visible del espectro, lo que garantiza el registro de espectros UV-B en el modo de escaneo. Esto hace posible registrar continuamente, a alta sensibilidad, espectros sin distorsiones de componentes que pasan rápidamente a través de una celda especial.

En comparación con la detección de longitud de onda única, que no proporciona información sobre la "pureza" del pico, la capacidad de comparar los espectros completos de la matriz de diodos proporciona un resultado de identificación con un grado de certeza mucho mayor.

Detector fluorescente. La gran popularidad de los detectores fluorescentes se debe a su muy alta selectividad y sensibilidad, y al hecho de que muchos contaminantes ambientales emiten fluorescencia (por ejemplo, los hidrocarburos poliaromáticos).

Un detector electroquímico se utiliza para detectar sustancias que se oxidan o reducen fácilmente: fenoles, mercaptanos, aminas, derivados nitro aromáticos y halógenos, aldehídos, cetonas, bencidinas.

La separación cromatográfica de la mezcla en la columna debido al lento avance del PF lleva mucho tiempo. Para acelerar el proceso, la cromatografía se realiza bajo presión. Este método se denomina cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

La modernización del equipo utilizado en la cromatografía en columna líquida clásica lo ha convertido en uno de los métodos de análisis más prometedores y modernos. La cromatografía líquida de alta resolución es un método conveniente para separar, aislar preparativamente y realizar análisis cualitativos y cuantitativos de compuestos termolábiles no volátiles de bajo y alto peso molecular.

Dependiendo del tipo de sorbente usado en este método, se usan 2 variantes de cromatografía: en un sorbente polar usando un eluyente no polar (opción de fase directa) y en un sorbente no polar usando un eluyente polar - el llamado inverso cromatografía líquida de alta resolución (RPHLC) de dos fases.

Cuando el eluyente pasa al eluyente, el equilibrio en condiciones de RPHLC se establece muchas veces más rápido que en las condiciones de adsorbentes polares y PF no acuosos. Como resultado de esto, además de la conveniencia de trabajar con agua y eluyentes hidroalcohólicos, RPHLC ahora ha ganado gran popularidad. La mayoría de los análisis de HPLC se llevan a cabo utilizando este método.

detectores El registro de la salida de la columna de un componente separado se realiza mediante un detector. Para el registro, puede utilizar el cambio en cualquier señal analítica proveniente de la fase móvil y relacionada con la naturaleza y cantidad del componente de la mezcla. La cromatografía líquida utiliza señales analíticas como la absorción de luz o la emisión de luz de la solución que sale (detectores fotométricos y fluorimétricos), índice de refracción (detectores refractométricos), conductividad eléctrica y potencial (detectores electroquímicos), etc.

La señal detectada continuamente es registrada por el registrador. El cromatograma es una secuencia de señales del detector registradas en la cinta de registro, generada cuando los componentes individuales de la mezcla salen de la columna. En el caso de separación de la mezcla, los picos individuales son visibles en el cromatograma externo. La posición del pico en el cromatograma se utiliza con fines de identificación de la sustancia, la altura o el área del pico, con fines de determinación cuantitativa.

2.1 Aplicación

HPLC encuentra la aplicación más amplia en las siguientes áreas de análisis químico (se identifican objetos de análisis donde HPLC prácticamente no tiene competencia):

· Control de calidad de los alimentos: aditivos tónicos y de sabor, aldehídos, cetonas, vitaminas, azúcares, colorantes, conservantes, hormonas, antibióticos, triazina, carbamato y otros pesticidas, micotoxinas, nitrosoaminas, hidrocarburos aromáticos policíclicos, etc.

· Protección del medio ambiente: fenoles, nitrocompuestos orgánicos, hidrocarburos aromáticos monocíclicos y policíclicos, varios pesticidas, aniones y cationes principales.

· Criminalística - drogas, explosivos y colorantes orgánicos, productos farmacéuticos potentes.

· Industria farmacéutica - hormonas esteroides, prácticamente todos los productos de síntesis orgánica, antibióticos, preparados poliméricos, vitaminas, preparados proteicos.

Medicina: las sustancias bioquímicas y medicinales enumeradas y sus metabolitos en fluidos biológicos (aminoácidos, purinas y pirimidinas, hormonas esteroides, lípidos) en el diagnóstico de enfermedades, determinando la tasa de excreción de drogas del cuerpo con el propósito de su dosificación individual .

· Agricultura - determinación de nitratos y fosfatos en suelos para determinar la cantidad necesaria de fertilizantes, determinación del valor nutritivo de los piensos (aminoácidos y vitaminas), análisis de plaguicidas en suelos, aguas y productos agrícolas.

Bioquímica, química bioorgánica, ingeniería genética, biotecnología - azúcares, lípidos, esteroides, proteínas, aminoácidos, nucleósidos y sus derivados, vitaminas, péptidos, oligonucleótidos, porfirinas, etc.

· Química orgánica - todos los productos estables de síntesis orgánica, colorantes, compuestos termolábiles, compuestos no volátiles; química inorgánica (prácticamente todos los compuestos solubles en forma de iones y compuestos complejos).

· Control de calidad y seguridad de productos alimenticios, bebidas alcohólicas y no alcohólicas, agua potable, productos químicos domésticos, perfumes en todas las etapas de su producción;

determinación de la naturaleza de la contaminación en el lugar de un desastre o emergencia provocado por el hombre;

detección y análisis de sustancias estupefacientes, potentes, venenosas y explosivas;

determinación de la presencia de sustancias nocivas (hidrocarburos policíclicos y otros aromáticos, fenoles, pesticidas, colorantes orgánicos, iones de metales pesados, alcalinos y alcalinotérreos) en efluentes líquidos, emisiones al aire y desechos sólidos de empresas y en organismos vivos;

· seguimiento de procesos de síntesis orgánica, procesamiento de petróleo y carbón, producciones bioquímicas y microbiológicas;

análisis de la calidad del suelo para la fertilización, la presencia de pesticidas y herbicidas en el suelo, el agua y los productos, así como el valor nutricional de los alimentos; tareas analíticas de investigación complejas; obteniendo una microcantidad de sustancia ultrapura.

CAPÍTULO 3. EJEMPLOS DE USO DE HPLC EN EL ANÁLISIS DE OBJETOS AMBIENTALES

HPLC: un método para monitorear PAH en objetos ambientales

Para los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH), ecotóxicos de la primera clase de peligro, se han establecido niveles extremadamente bajos de concentraciones máximas permisibles (MAC) en objetos naturales. La determinación de PAH al nivel de MPC e inferior es una de las tareas analíticas más complejas y se utilizan métodos de análisis de alta tecnología (GC-MS, GC, HPLC) para resolverlas. Al elegir un método para monitorear, además de las características principales en consideración, se agregan sensibilidad y selectividad, expresividad y economía, porque. el seguimiento implica un análisis en serie. La variante de HPLC en columnas cortas de pequeño diámetro cumple en gran medida estos requisitos. Utilizando este método, los autores desarrollaron y certificaron métodos para monitorear el benzo[a]pireno en tres medios naturales: aerosoles, cubierta de nieve y aguas superficiales. Los métodos se caracterizan por: preparación simple de muestras unificadas, incluida la extracción de PAH con disolventes orgánicos y concentración del extracto, introducción directa de un extracto concentrado en una columna cromatográfica, uso de detección fotométrica de longitud de onda múltiple en la región UV del espectro, identificación de picos de PAH en cromatogramas utilizando dos parámetros, tiempo de retención y relación espectral. El error total no supera el 10 % al determinar benz[a]pireno en aerosol en el rango de concentración de 0,3 a 450 ng/m hasta 50 μg/m 2 . Para el caso de determinación simultánea de HAP prioritarios (hasta 12 compuestos) y registro de picos no homogéneos de analitos, se propuso reseparar el extracto con un cambio en la selectividad de la fase móvil, la longitud de onda de detección y la temperatura de la columna, teniendo en cuenta las propiedades individuales de los PAH que se están determinando.

1 . Calidad del aire ambiente. Concentración en masa de benzo[a]pireno. El procedimiento para realizar mediciones por el método HPLC. Certificado de atestación MVI No. 01-2000.

2 . La calidad de las aguas residuales superficiales y tratadas. Concentración en masa de benzo[a]pireno. El procedimiento para realizar mediciones por el método HPLC. Certificado de constancia MVI No. 01-2001.

3 . Calidad de la capa de nieve. Concentración en masa de benzo[a]pireno. El procedimiento para realizar mediciones por el método HPLC. Certificado de constancia MVI No. 02-2001.

Eliminación de anilina de soluciones acuosas utilizando desechos de recuperación aluminotérmica de cascarilla de cobre laminado

El problema de la remoción de hidrocarburos de las aguas residuales es una tarea urgente. En muchas industrias químicas, petroquímicas y otras, se forma anilina y sus derivados, que son sustancias tóxicas. La anilina es una sustancia altamente tóxica, MPC - 0,1 mg / m 3. La anilina y sus derivados son solubles en agua y, por lo tanto, no pueden eliminarse por sedimentación gravitacional.

Uno de los mejores métodos de tratamiento de aguas residuales de contaminantes orgánicos es el uso de adsorbentes inorgánicos y orgánicos con capacidad de regeneración (aluminosilicatos, arcillas modificadas, madera, fibras, etc.) e incapaces de regeneración (carbón activado, materiales poliméricos macroporosos, etc.) . ).

Los adsorbentes regenerados pueden eliminar sustancias orgánicas de diferente polaridad del agua. La búsqueda de adsorbentes efectivos es una tarea urgente.

Este informe presenta los resultados de un estudio en el campo del uso de la cascarilla de cobre molido de la planta de cable de Ereván (OPMOERKZ) como adsorbentes de anilina.

Los estudios cromatográficos se realizaron en un cromatógrafo HPLC/cromatografía líquida de alta resolución/sistemas (Waters 486 - detector, Waters 600S - controlador, Waters 626 - Bomba), en una columna de 250 x 4 mm llena de sorbentes en estudio, fase móvil tasa 1 ml/m/fase móvil son los solventes que estamos estudiando/, el detector es UV-254. El análisis espectroscópico UV se realizó en un espectrofotómetro Specord-50, los espectros se obtuvieron utilizando el programa informático ASPECT PLUS.

Se añadieron porciones de adsorbentes pesados con precisión a ciertos volúmenes de anilina en agua, cuyas concentraciones iniciales variaron. La mezcla se agitó intensamente durante 6 horas y luego se dejó reposar la muestra. La adsorción se completa en casi 48 horas.La cantidad de anilina precipitada se determinó por espectrofotometría UV así como por análisis refractivo.

En un primer momento, se estudiaron las propiedades de adsorción de OPMOEPKZ durante la eliminación de anilina de una solución en tetracloruro de carbono. Resultó que la anilina absorbe mejor el sorbente 3 (tabla).

También se realizaron mediciones para soluciones acuosas de anilina a concentraciones de 0,01-0,0001 mol/l. La tabla muestra los datos de una solución de 0,01 M.

Absorción de anilina por varios sorbentes de una solución acuosa de anilina 0,01 M a 20 °C

Previamente se encontró que la adsorción dentro de los rangos de concentración indicados aumenta y depende linealmente del índice de refracción. La cantidad de anilina se determinó a partir del gráfico del índice de refracción frente a la concentración molar y se corrigió tanto por cromatografía líquida como por análisis espectral UV.

El sorbente 3 es el más activo para soluciones acuosas.La cantidad de contaminante adsorbido se calculó como la diferencia entre la cantidad total de contaminante añadida a la solución inicial y su residuo en la solución final.

Métodos para determinar HAP en objetos ambientales

Por lo general, los métodos de cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utilizan para determinar los PAH. la separación de los 16 PAH principales suficientes para el análisis cuantitativo se logra utilizando columnas capilares en cromatografía de gases o columnas de alto rendimiento utilizadas en HPLC. Debe recordarse que una columna que separa bien las mezclas de calibración de dieciséis PAH no garantiza que también estarán bien separadas en el contexto de los compuestos orgánicos acompañantes en las muestras en estudio.

Para simplificar el análisis, así como para lograr una alta calidad de los resultados obtenidos, la mayoría de los procedimientos analíticos contienen la etapa de aislamiento preliminar (separación) de los PAH de otros grupos de compuestos relacionados en las muestras. Los métodos más comunes utilizados para este fin son la cromatografía líquida de baja presión en sistemas líquido-sólido o líquido-líquido mediante mecanismos de adsorción, como el uso de gel de sílice o alúmina, en ocasiones se utilizan mecanismos mixtos, como la adsorción y la exclusión mediante Sephadex.

El uso de pretratamiento de muestras permite evitar la influencia de:

Compuestos completamente no polares como hidrocarburos alifáticos;

Compuestos moderada y fuertemente polares, por ejemplo, ftalano, fenoles, alcoholes polihídricos, ácidos;

Compuestos de alto peso molecular como, por ejemplo, resinas.

En la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utilizan principalmente dos tipos de detectores: un detector fluorimétrico o un detector espectrofotométrico de barra de fotodiodo. El límite de detección de PAH en la detección fluorimétrica es muy bajo, lo que hace que este método sea especialmente adecuado para la determinación de cantidades traza de compuestos poliaromáticos. Sin embargo, los detectores fluorimétricos clásicos prácticamente no proporcionan información sobre la estructura del compuesto en estudio. Los diseños modernos permiten registrar espectros de fluorescencia que son característicos de compuestos individuales, pero aún no se han generalizado en la práctica de las mediciones de rutina. Un detector espectrofotométrico con línea de fotodiodo (PDL) permite registrar espectros de absorción en el rango espectral UV y visible, estos espectros se pueden utilizar para la identificación. Se puede obtener información similar usando detectores de escaneo rápido.

A la hora de elegir una técnica analítica para la separación, identificación y cuantificación de estos HAP, se deben tener en cuenta las siguientes condiciones:

El nivel de contenidos determinados en las muestras estudiadas;

El número de sustancias relacionadas;

Procedimiento analítico aplicado (técnica de medición);

Las posibilidades del equipo de serie.

Desarrollo de un método para la determinación de elementos alcalinotérreos y magnesio por cromatografía líquida iónica de alta resolución

El desarrollo y mejora de métodos que permitan resolver problemas de análisis de aguas es un problema importante en la química analítica. El desarrollo de la cromatografía líquida de alta presión y alto rendimiento estimuló el desarrollo de una nueva dirección en la cromatografía de intercambio iónico, la llamada cromatografía iónica. La síntesis de adsorbentes para cromatografía iónica es difícil, ya que se les imponen muchos requisitos. Debido a la falta de intercambiadores de cationes de alto rendimiento comercialmente disponibles, se utilizó una fase inversa modificada dinámicamente, para lo cual se sintetizó un modificador: ácido N-hexadecil-N-decanoil-para-amino-benoilsulfónico etil-diisopropilamonio (DGDASC), donde la amina hidrofóbica que contiene el grupo SO 3 -, capaz de intercambio catiónico. Después de pasar la solución modificadora, la absorción a l = 260 nm alcanzó 6,4 unidades de densidad óptica (° E) alcanzando una meseta. La capacidad de intercambio iónico calculada es de 15,65 µmol. Dado que los cationes de los elementos alcalinotérreos y el magnesio no se absorben en la región UV del espectro, se usó la detección indirecta de UV utilizando el eluyente absorbente de UV sintetizado bromuro de 1,4-dipiridinio butano (bromuro de DPB). Dado que los iones de halógeno destruyen las partes de acero de la columna, el ion bromuro del 1,4-dipiridinio butano se reemplazó por un ion acetato. Cuando la columna se lava con el eluyente, el contraión del modificador, etildiisopropilamonio, se reemplaza por el ion absorbente de UV 1,4-dipiridiniobutano. La separación de cationes se llevó a cabo a la longitud de onda óptima l = 260 nm en una escala de 0,4 A en el modo de "plegamiento de escala"; la polaridad de la grabadora estaba invertida. La separación de todos los cationes estudiados se logró con la introducción de un aditivo complejante: ácido oxálico. Los límites de detección de Mg 2+ , Ca 2+ , Sr 2+ , Ba 2+ son 8 μg/l; 16 µg/l; 34 µg/l; 72 µg/l, respectivamente. En las condiciones seleccionadas se analizó agua corriente cuyo contenido de Ca 2+ es de 10,6 +1,9 mg-ion/l, Mg 2+ -2,5 + mg-ion/l. El error de reproducibilidad no supera el -2,2 % para Ca 2+ y el 1,4 % para Mg 2+.

Análisis de complejos de cadmio en el medio ambiente

Para estudiar los mecanismos de migración de los metales pesados en la biosfera, se necesitan datos sobre las formas químicas de existencia de los metales en la naturaleza. Las dificultades en el análisis de compuestos de uno de los metales más tóxicos, el cadmio, están asociadas al hecho de que forma complejos inestables, y al intentar aislarlos se distorsionan los equilibrios naturales. En este trabajo se estudiaron los compuestos de cadmio en suelos y plantas mediante una técnica basada en la separación cromatográfica de extractos seguida de la identificación de los componentes por análisis químico. Este enfoque hizo posible no solo identificar las formas químicas del cadmio, sino también rastrear sus transformaciones en objetos ambientales.

Los grupos OH de carbohidratos y polifenoles (incluidos los flavonoides), C=O, fosfatos, NH 2 , NO 2 , los grupos SH están coordinados con el cadmio en los objetos de la biosfera. Para los fines de este estudio, se compiló un conjunto de ligandos modelo que representan estas clases de compuestos. La interacción de los ligandos modelo con las sales de cadmio solubles en agua se estudió mediante espectroscopia UV y HPLC.

Para aislar los compuestos de cadmio, se utilizó la extracción con solventes especialmente seleccionados (que no forman complejos con Cd). De esta forma, el cadmio se puede separar de todos los metales pesados, excepto de su análogo químico cercano, el zinc. Los picos que contienen cadmio y zinc en los cromatogramas de los extractos obtenidos se detectaron mediante la unión de metales en forma de sus ditizonatos. Para separar del zinc se utilizó la diferencia en la estabilidad de los complejos de Cd y Zn a pH 6-8. Los compuestos de Cd aislados se identificaron por HPLC con cambios de pH durante la elución. Se realizó un análisis de compuestos de cadmio con componentes del suelo y tejidos vegetales, y se identificaron sustancias producidas por las plantas en respuesta a un aumento en la ingesta de cadmio del suelo. Se ha demostrado que los flavonoides, en particular la tricina, son agentes protectores en los cereales, los alcoxi derivados de la cisteína en las leguminosas, y tanto los polifenoles como los tioles en las crucíferas.

CAPÍTULO 4. EQUIPOS DE HPLC

SERIE ACCELA

El nuevo cromatógrafo de líquidos de rendimiento ultraalto ACCELA es capaz de operar en una amplia gama de caudales y presiones, proporcionando tanto separaciones HPLC típicas en columnas convencionales como separaciones ultrarrápidas y eficientes en columnas con un tamaño de partícula adsorbente de menos de 2 µm a Presiones ultra altas (superiores a 1000 atm.).

El sistema incluye una bomba inerte de gradiente cuaternario capaz de generar presiones superiores a 1000 atm y con un volumen de retardo de solo 65 µl, lo que proporciona separaciones cromatográficas de alta velocidad. Automuestreador ACCELA capaz de operar en un ciclo de inyección de muestra de 30 segundos y proporciona la más alta reproducibilidad de inyección. Detector de red de diodos Accela PDA con un volumen de celda de flujo minimizado (2 µl) está optimizado para cromatografía de alta velocidad, utiliza tecnología LightPipe patentada y mantiene la forma de pico simétrica que viene con un sistema de cromatografía y columnas impecables.

El sistema se empareja perfectamente con los espectrómetros de masas para crear los mejores y más potentes sistemas LC/MS disponibles en el mundo.

Columnas UHP de 1,9 µm disponibles de Thermo Electron para todas las aplicaciones

SERIE TSP

El principio modular de construcción de los instrumentos de HPLC permite al cliente completar de forma flexible el equipo para resolver cualquier problema analítico y, cuando cambia, puede modificarse de forma rápida y económica. La amplia gama de módulos incluye bombas de gradiente isocrático a cuaternario, de microcolumna a semipreparativo, todos los detectores disponibles, sistemas de inyección de muestras, desde inyectores manuales hasta muestreadores automáticos con la capacidad de manejar cualquier muestra, software potente para procesar resultados de medición y administrar todos los módulos del sistema. Todos los módulos están certificados según CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, son compactos, tienen un diseño moderno, son fáciles de operar, están equipados con una pantalla integrada y auto- sistema de diagnóstico, le permite crear y almacenar métodos de tareas en parámetros de memoria. Cumplen con los criterios de "Práctica de laboratorio ejemplar" (GLP) y están incluidos en el Registro de instrumentos de medición de la Federación Rusa. Los protocolos de medición se emiten de acuerdo con las Farmacopeas de Inglaterra, EE. UU., Alemania y Francia.

Los sistemas modulares TSP se caracterizan por la máxima fiabilidad y estabilidad de funcionamiento.

La combinación de módulos proporciona al analista todas las ventajas de un sistema integrado por un lado y la flexibilidad de un sistema modular por el otro. Cualquiera que sea el campo de aplicación de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (farmacología, biotecnología, análisis ambiental, análisis clínico, análisis de alimentos y bebidas, análisis petroquímico y químico), este instrumento se utiliza, siempre está configurado de manera óptima para cumplir con los requisitos más exigentes. .

Tanto los sistemas de rutina de investigación como los de alto rendimiento proporcionan:

Desgasificación de solventes altamente eficiente

Capacidad para trabajar con cantidades de muestra pequeñas y ultrapequeñas

Máxima sensibilidad, tanto con detector UV/VIS como con matriz de diodos (con la famosa tecnología LightPipe con opción de longitud de camino óptico de 1 o 5 cm)

Trabajando con diferentes columnas

Precisión cuantitativa más alta

Posibilidad de trabajo automático con diferentes volúmenes de muestra

Error de tiempo de retención RMS inferior al 0,3 %

El área mínima de trabajo ocupada por el sistema.

Máxima fiabilidad y estabilidad de parámetros.

Bomba Surveyor LC- Una bomba HPLC con la mejor reproducibilidad del tiempo de retención de cualquier bomba de gradiente de 4 componentes disponible en el mundo. Un desgasificador de vacío de canal cuádruple integrado y un amortiguador de pulsaciones proporcionan una excelente estabilidad de línea de base para lograr la máxima precisión y sensibilidad de cuantificación.

El muestreador automático proporciona el máximo rendimiento y flexibilidad de análisis. Una amplia gama de bandejas de muestras, desde viales estándar hasta microplacas de 96 y 384 pocillos, cubre las necesidades de prácticamente todas las aplicaciones. La nueva tecnología proporciona prácticamente ninguna pérdida de inyección de muestra, se inyectan prácticamente 5 µl de muestra con un muestreador automático de un volumen total de muestra de 5 µl.

TOPÓGRAFO

Detector UV/Visual y PDA (Detector de Matriz de Diodos)

Topógrafo UV/Vis- El detector de luz visible y ultravioleta de longitud de onda variable es una combinación de economía y confiabilidad con la más alta sensibilidad de la tecnología LightPipe. Una amplia selección de celdas de flujo hace que este detector sea versátil para todas las aplicaciones, desde aquellas que usan cromatografía capilar o de microcolumna hasta semipreparativas y preparativas.

Topógrafo PDA El detector es el más sensible entre todos los detectores de matriz de diodos HPLC. La óptica de fuente de lámpara dual cubre perfectamente todo el rango de longitud de onda de 190 a 800 nm. El formador de haz de fibra óptica proporciona una excelente resolución óptica sin sacrificar la sensibilidad.

Agrimensor RI detector refractométrico con cubeta termostatizada de mínimo volumen con control electrónico completo desde un ordenador.

Topógrafo FL detector de barrido fluorométrico con la más alta sensibilidad y capacidad de detección para fluorescencia, quimioluminiscencia y fosforescencia.

Una amplia gama de muestreadores automáticos le permite trabajar tanto con viales convencionales como con placas de 96 posiciones, ampliamente utilizadas en bioquímica y práctica clínica. El manejo se ve facilitado por el uso de placas de preparación de muestras SPE similares.

400 Accionamiento eléctrico, bucle Valco (20 µl - estándar) con posibilidad de llenado parcial.

Carrusel 96 muestras.

Accionamiento eléctrico, termostato de columna, bucle Valco (100 µl - estándar) con posibilidad de llenado parcial Modo AutoMix para preparación de muestras. Carrusel de muestras: 84 x 2 ml (muestras) + 3 x 10 ml (reactivos). Termostato de columna incorporado. 420

Automuestreador de bucle para trabajos de investigación con la capacidad de trabajar en los modos de llenado total, parcial e introducción de muestras de microlitros. Una amplia gama de carruseles (estándar - 96 muestras).

Automuestreador de tabletas para placas de 96 y 384 posiciones. Inyección de la muestra en el circuito de presión, posibilidad de introducir muestras de menos de 1 µl. Posibilidad de instalar un alimentador de tabletas. HPLC

Principales fabricantes de equipos HPLC

· Aguas - cromatografía de alta resolución, espectrometría de masas, columnas, extracción en fase sólida;

varian, inc. - cromatógrafos y columnas, accesorios para extracción en fase sólida;

· Agilent Technologies - cromatógrafos y columnas;

· Hypersil - columnas y adsorbentes.

· Merck KGaA - Placas TLC y accesorios para TLC, columnas, adsorbentes, fases móviles para HPLC, accesorios para extracción en fase sólida

· Dionex - equipos y columnas para HPLC, especialmente para cromatografía iónica.

Literatura

1.Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Química analítica. En dos libros: kn..1 - M .: Química, 1990, -480s.

1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Química analítica. En dos libros: kn..2 - M .: Química, 1990, -480s.

2. Vasiliev V.P. Química analítica. A las 14 h Parte 2. Métodos físicos y químicos de análisis: Proc. para Khimko - tecnología. especialista. universidades - M.: Superior. escuela, 1989. - 384p.

3. Materiales hidroquímicos. Tomo 100. Métodos y medios técnicos de vigilancia operativa de la calidad de las aguas superficiales. L.: Gidrometeo-izdat, 1991. - 200p.

4. Lurie Yu.Yu. Química analítica de aguas residuales industriales / Yu.Yu. Lurie; M.: Química Yu, 1984. - 448s.

5. Ewing G. Métodos instrumentales de análisis químico / Per. De inglés. M.: Mir, 1989. - 348 p.

6. Gorelik DO, Konopelko L.A., Pankov E.D. Monitoreo ambiental. En 2 volúmenes San Petersburgo: Navidad. 2000. - 260 págs.

7. Aivazov B.V. Introducción a la cromatografía. M.: Superior. escuela, 1983. - 450 p.

8. Goldberg K.A., Vigdergauz M.S. Introducción a la cromatografía de gases. M.: Química, 1990. - 329 p.

9. Stolyarov B.V. y otros // Prácticas de cromatografía de gases y líquidos. San Petersburgo: Universidad Estatal de San Petersburgo, 1998. - S. 81.

11. Gorshkov A.G., Marinaite I.I. HPLC: un método para monitorear PAH en objetos ambientales

12. Torosyan G. O., Martirosyan V. A., Aleksanyan A. R., Zakaryan M. O. Eliminación de anilina de soluciones acuosas utilizando productos de desecho de reducción aluminotérmica de incrustaciones de cobre laminado

13. Los Ángeles Turkina, G. N. Koroleva Desarrollo de un método para la determinación de elementos alcalinotérreos y magnesio por cromatografía líquida iónica de alta resolución

14. Dultseva G.G., Dubtsova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. Análisis de complejos de cadmio en el medio ambiente

Apéndice

DETERMINACIÓN DE CLOMAZONA EN AGUA POR MÉTODOS CROMATOGRAFICOS

INSTRUCCIONES METODOLÓGICAS MUK 4.1.1415-03

1. Elaborado por: Centro Científico Federal de Higiene. F. F.

Erismán; Academia Agrícola de Moscú. K. A.

Timiryazev; con la participación del Departamento Estatal de Vigilancia Sanitaria y Epidemiológica del Ministerio de Salud de Rusia. Los desarrolladores de la metodología se enumeran al final.

3. Aprobado por el Médico Jefe de Sanidad del Estado

Federación Rusa, Primer Viceministro de Salud de la Federación Rusa, acad. RAMS G.G. Onishchenko 24 de junio de 2003

5. Presentado por primera vez.

1. Introducción

Fabricante: FMS (EE.UU.).

Nombre comercial: COMANDO.

Principio activo: clomazona.

2-(2-clorobencil)-4,4-dimetil-3-isoxalidin-3-ona (IUPAC)

Líquido viscoso de color marrón claro.

Punto de fusión: 25 -C.

Punto de ebullición: 275 -C.

Presión de vapor a 25 -C: 19,2 MPa.

Coeficiente de reparto n-octanol/agua: K logP = 2,5.

Altamente soluble en acetona, hexano, etanol, metanol,

cloroformo, diclorometano y acetonitrilo; solubilidad en agua -

1,10 g/pie DM Estable a temperatura ambiente durante al menos 2 años, a 50 -C - al menos 3 meses.

Breve perfil toxicológico: Oral aguda

toxicidad (LD) para ratas - 1369 - 2077 mg/kg; dérmica aguda

toxicidad (LD) para ratas - más de 2000 mg/kg; agudo

toxicidad por inhalación (LC) para ratas - 4,8 mg / cu. dm (4 horas).

Normas higiénicas. MPC en agua - 0,02 mg / cu. DM

Alcance de la droga. Clomazone es un herbicida selectivo utilizado para el control de cereales y malas hierbas dicotiledóneas en cultivos de soja y arroz durante la aplicación previa a la emergencia o la siembra.

2. Método para la determinación de clomazona en agua.

métodos cromatográficos

2.1. Puntos clave

2.1.1. El principio de la técnica.

La técnica se basa en la extracción de clomazone de la muestra analizada con hexano, concentración del extracto y posterior determinación cuantitativa por métodos alternativos:

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con

detector ultravioleta, cromatografía gas-líquido (GLC) con un detector de velocidad de recombinación constante o cromatografía en capa fina (TLC). La determinación cuantitativa se lleva a cabo por el método de calibración absoluta.

2.1.2. Selectividad del método

En las condiciones propuestas, el método es específico en presencia de contaminantes ambientales globales: derivados clorados de cicloparafinas (isómeros de HCH), compuestos de difenilo (DDT y sus derivados), sus metabolitos - bencenos policlorados y fenoles, así como en presencia de tricloroacetato de sodio, que se puede utilizar en cultivos como herbicida.

2.1.3. Característica metrológica del método (P = 0,95)

Reactivos, soluciones y materiales.

Clomazone con el contenido de d. 99,8%

(FMS, EE. UU.)

Nitrógeno, y GOST 9293-79

Agua amoníaco, 25%, h GOST 1277-81

Acetona, h GOST 2603-79

n-Hexano, h GOST 2603-79

Peróxido de hidrógeno, solución acuosa al 30% GOST 10929-77

Alcohol isopropílico, químicamente puro TU 6-09-402-75

Ácido sulfúrico, químicamente puro GOST 4203-77

Ácido clorhídrico (clorhídrico), químicamente puro GOST 3118-77

Alcohol metílico, GOST químicamente puro

Hidróxido de sodio, químicamente puro, solución acuosa al 25% GOST 4323-77

Sulfato de sodio anhidro, químicamente puro GOST 1277-81

Nitrato de plata, químicamente puro GOST 1277-81

2-fenoximetanol, h TU 6-09-3688-76

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm)

con 5% SE-30, Hemapol, República Checa

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm) con 1,5

OV-17 + 1,95% QF-1, Hemapol, República Checa

Placas para HPTLC (URSS)

Registros "Kieselgel 60 F-254" (Alemania)

Registros "Silufol" República Checa

Filtros de papel "cinta blanca", sin cenizas y prelavado con hexano TU 6-09-2678-77

2.3. Cubiertos, equipo, utensilios

Cromatógrafo de líquidos Milichrome

con detector ultravioleta

Columna cromatográfica de acero,

longitud 64 mm, diámetro interior 2 mm,

relleno con Silasorb 600, tamaño de grano 5 µm

Cromatógrafo de gases serie "Color" o

similar, equipado con un detector constante

tasa de recombinación (RPR) con un límite

detección por lindano 4 x 10 g/cu. cm

Columna de vidrio cromatográfico, longitud

1 o 2 m, diámetro interior 2 - 3 mm

Microjeringa tipo MSH-10, capacidad 10 µl TU 5E2-833-024

Aparato de agitación tipo AVU-6s TU 64-1-2851-78

Baño de agua TU 64-1-2850-76

Balanza analítica tipo VLA-200 GOST 34104-80E

Cámara cromatográfica GOST 10565-74

Bomba de chorro de agua GOST 10696-75

Irradiador de mercurio-cuarzo tipo OKN-11 TU 64-1-1618-77

Pistolas de vidrio GOST 10391-74

Evaporador rotativo al vacío IR-1M

o similar TU 25-11-917-76

Unidad compresora TU 64-1-2985-78

Armario de secado TU 64-1-1411-76E

Embudos divisorios GOST 3613-75

Matraces volumétricos, con una capacidad de 100 ml GOST 1770-74

Probetas graduadas, con una capacidad de 10, 50 ml GOST 1770-74E

Frascos en forma de pera con una sección delgada,

con una capacidad de 100 ml GOST 10394-72

Matraces cónicos, con una capacidad de 100 ml GOST 22524-77

Tubos de ensayo de centrífuga, medidos GOST 25336-82E

Pipetas, con capacidad de 0,1, 1, 2, 5 y 10 ml GOST 20292-74

Embudos químicos, cónicos, diámetro

34 - 40 mm GOST 25336-82E

2.4. Selección de muestras

El muestreo, el almacenamiento y la preparación de las muestras se llevan a cabo de acuerdo con

"Reglas unificadas para el muestreo de productos agrícolas, productos alimenticios y objetos ambientales para la determinación de cantidades traza de pesticidas", aprobada por N 2051-79 del 21.08.79

Las muestras tomadas se pueden almacenar en el refrigerador hasta por 5 días. Antes del análisis, el agua (en presencia de suspensión) se filtra a través de un filtro de papel suelto.

2.5. Preparación para la definición

2.5.1. Método HPLC

2.5.1.1. Preparación de fase móvil para HPLC

En un matraz aforado de 100 ml de capacidad se colocan con una pipeta 5 ml de isopopanol y 5 ml de metanol, se completa hasta el enrase con hexano, se mezcla, se filtra.

2.5.1.2. Acondicionamiento de columna

Enjuague la columna de HPLC con hexano-metanol-isopropanol (90:5:5, v/v) durante 30 min. a una velocidad de alimentación de disolvente de 100 µl/min.

2.5.2. método GLC. Preparación y acondicionamiento de columnas

El relleno terminado (5% SE-30 en Chromaton N-AW-DMCS) se vierte en una columna de vidrio, se compacta al vacío, la columna se instala en el cromatógrafo termostato sin conectar al detector y se estabiliza en una corriente de nitrógeno a una temperatura de 250 -C durante 10 - 12 del mediodía

2.5.3. método CCF

2.5.3.1. Preparación de reactivos de desarrollo.

2.5.3.1.1. Reactivo de revelado nº 1

Se disuelve 1 g de nitrato de plata en 1 ml de agua destilada, se agregan 10 ml de 2-fenoximetanol, 190 ml de acetona, 1-2 gotas de peróxido de hidrógeno, la solución se agita y se transfiere a una botella de vidrio oscuro.

2.5.3.2.2. Reactivo de revelado N 2

Se disuelven 0.5 g de nitrato de plata en 5 ml de agua destilada en un matraz aforado de 100 ml, se agregan 10 ml de amoníaco acuoso al 25%, se ajusta la solución a 100 ml con acetona, se mezcla y se transfiere a un frasco de vidrio oscuro.

2.5.3.2. Preparación de la fase móvil para TLC

En un matraz aforado de 100 ml de capacidad agregar 20 ml de acetona y agregar hexano hasta el enrase, mezclar. La mezcla se vierte en la cámara cromatográfica con una capa de no más de 6 - 8 mm en 30 minutos. Antes de iniciar la cromatografía.

2.5.4. Preparación de soluciones estándar

Se prepara una solución estándar madre de clomazona de 100 µg/mL disolviendo 0,010 g de una preparación que contiene 99,8 % de AI en hexano en un matraz volumétrico de 100 mL. La solución se almacena en el refrigerador durante un mes.

Soluciones estándar de trabajo con una concentración de 0,4; 1,0; 2.0; 4.0; 10,0; Se preparan 20 y 40,0 µg/ml a partir de la solución estándar madre de clomazona mediante diluciones seriadas apropiadas con hexano.

Las soluciones de trabajo se almacenan en el refrigerador por no más de un mes.

2.5.5. Construcción de un gráfico de calibración

2.5.5.1. Curva de calibración A (medición según el párrafo 2.7.1, HPLC)

Para construir un gráfico de calibración, se inyectan 5 µl de una solución estándar de trabajo de clomazone con una concentración de 4,0 en el inyector del cromatógrafo; 10,0; 20,0 y 40 µg/ml.

2.5.5.2. Curva de calibración B (medición según el párrafo 2.7.2, GLC)

Para construir un gráfico de calibración, se inyectan 5 µl de una solución estándar de trabajo de clomazone con una concentración de 0,4 en el evaporador del cromatógrafo; 1,0; 2.0; 4.0 y 10.0.

Realice al menos 5 mediciones paralelas. Encuentre la altura promedio del pico cromatográfico para cada concentración. Construya un gráfico de calibración (A o B) de la dependencia de la altura del pico cromatográfico en mm de la concentración de clomazone en solución en µg/ml.

2.6. Definición Descripción

Se colocan 100 ml de la muestra de agua analizada en un embudo de decantación de 250 ml de capacidad, se añaden 10 ml de una solución acuosa al 25% de hidróxido de sodio, se mezcla y se añaden 20 ml de n-hexano. El embudo se agita durante 3 minutos, después de la separación de fases, la capa de hexano se vierte en un matraz en forma de pera con una capacidad de 100 ml, pasándolo a través de una capa de sulfato de sodio anhidro colocado en un embudo cónico sobre un papel de filtro plegado. La extracción del fármaco de la muestra acuosa se repite dos veces más utilizando 20 ml de n-hexano. El extracto de hexano combinado se evapora en un evaporador de vacío rotatorio a una temperatura de 40 -C casi hasta la sequedad, el residuo se elimina con una corriente de aire o nitrógeno de pureza especial. El residuo seco se disuelve en 0,1 (HPLC, TLC) o 0,25 ml (GLC) de n-hexano y se analiza por uno de los métodos cromatográficos.

2.7. Condiciones de cromatografía

Cromatógrafo de líquidos con detector ultravioleta Milichrom (Rusia).

Columna de acero de 64 mm de largo, diámetro interior de 2 mm,

lleno de Silasorb 600, granulometría 5 micras.

Temperatura de la columna: ambiente.

Fase móvil: hexano-isopropanol-metanol (90:5:5, v/v).

Caudal de eluyente: 100 µl/min.

Longitud de onda de funcionamiento: 240 nm.

Sensibilidad: 0,4 unidades absorción en la escala.

Volumen de inyección: 5 µl.

Tiempo de salida de Clomazone: unos 6 min.

Rango de detección lineal: 20 - 200 ng.

Las muestras que producen picos superiores a la solución estándar de 40 µg/ml se diluyen con fase móvil de HPLC.

Cromatógrafo de gases "Tsvet-570" con detector de tasa de recombinación de iones constante.

Columna de vidrio de 1 m de largo, 3 mm de diámetro interior, rellena con Chromaton N-AW-DMCS con 5% SE-30 (0,16 - 0,20 mm).

La escala de trabajo del electrómetro es 64 x 10 10 Ohm.

Grabadora de velocidad de cinta 200 mm/h.

Temperatura del termostato de columna - 190 -C

detector - 300 -C

evaporador - 220 -C

La velocidad del gas portador (nitrógeno) - 60 ml / min.

El volumen de la muestra inyectada es de 5 µl.

El tiempo de salida de la clomazona es de 2,5 minutos.

Rango de detección lineal: 2 - 50 ng.

Las muestras que producen picos mayores que la solución estándar de 10 µg/mL se diluyen con hexano.

Para mejorar la precisión de la identificación de la clomazona en presencia de gamma-HCCH que tiene un tiempo de retención cercano en la muestra, la clomazona se elimina de la muestra mediante tratamiento con ácido sulfúrico concentrado. El nuevo análisis de la muestra le permite establecer la contribución de la clomazona a la señal cromatográfica primaria.

Solución de hexano en un matraz, obtenido de acuerdo con el párrafo 2.6 cuantitativamente

(o una alícuota del mismo) se aplica a las placas cromatográficas "Silufol", "Kieselgel 60F-254" o "Plates for HPTLC". Cerca, las soluciones estándar se aplican en un volumen correspondiente al contenido de clomazone 1, 2, 5 y 10 μg. La placa se coloca en una cámara cromatográfica que contiene una mezcla de n-hexano-acetona (4:1, v/v). Después del revelado del cromatograma, la placa se retira de la cámara, se coloca bajo corriente de aire hasta que se evaporen los solventes, luego se trata con uno de los reactivos de revelado y se coloca bajo una lámpara ultravioleta durante 5 minutos. La zona de localización del fármaco en las placas "Silufol", "Placas para HPTLC" y "Kieselgel 60F-254" aparece como manchas de color marrón grisáceo con un valor Rf de 0,35, 0,85 y 0,43, respectivamente. Para determinar la clomazona por TLC, puede usar placas "Alugram" y "Polygram" (fabricadas por Alemania). El valor Rf de la clomazona en estas placas es 0,37 y 0,38, respectivamente.

3. Requisitos de seguridad

Es necesario seguir las reglas de seguridad generalmente aceptadas cuando se trabaja con solventes orgánicos, sustancias tóxicas, calentadores eléctricos.

4. Control de errores de medición

El control operativo del error y la reproducibilidad de las mediciones se lleva a cabo de acuerdo con las recomendaciones de MI 2335-95. GSI "Control de calidad interno de los resultados de análisis químicos cuantitativos".

5. Desarrolladores

Yudina T.V., Fedorova N.E. (FNTSG llamado así por FF Erisman).

Davidyuk E. I. (UkrNIIGINTOX, Kiev); Kisenko M.A., Demchenko V.F. (Instituto de Medicina del Trabajo de la Academia de Ciencias y la Academia de Ciencias Médicas de Ucrania, Kiev).

Según el mecanismo de separación de las sustancias analizadas o separadas, la HPLC se divide en adsorción, distribución, intercambio iónico, exclusión, intercambio de ligandos y otros.

HPLC en fase normal

La fase estacionaria es más polar que la fase móvil, por lo que el disolvente no polar predomina en la composición del eluyente:

Hexano:isopropanol = 95:5 (para sustancias poco polares)
Cloroformo:metanol = 95:5 (para sustancias polares medias)
Cloroformo:metanol = 80:20 (para sustancias altamente polares)

HPLC de fase inversa

Los eluyentes comunes para HPLC de fase inversa son:

Acetonitrilo: agua
metanol: agua
Isopropanol: agua

Matrices para HPLC

Las principales características de la matriz:

Tamaño de partícula (µm);
Tamaño de poro interno (Å, nm).

Obtención de gel de sílice para HPLC:

Formación de microesferas de ácido polisilícico;
Secado de partículas de gel de sílice;
Separación de aire.

Partículas absorbentes:

Regular (esférica): mayor resistencia a la presión, mayor costo;
No esférica: menor resistencia a la presión.

Injertos de fase estacionaria

HPLC en fase normal:

Fase estacionaria injertada con propilnitrilo (nitrilo);
Fase estacionaria con injerto de propilamina (amina).

HPLC de fase inversa:

Fase estacionaria con injerto de alquilo;
Fase estacionaria con injerto de alquilsililo.

detectores de HPLC

ultravioleta
matriz de diodos
Fluorescente
electroquímico
refractométrico
selectivo de masas

Enlaces

Fundación Wikimedia. 2010 .

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Cromatografía líquida, para aumentar la eficiencia de la separación, el solvente (eluyente) bajo presión (más de 3x107 Pa) se bombea a través de columnas llenas de un sorbente con partículas de pequeño diámetro (hasta 1 μm) y perfusión ... ...

Un tipo de cromatografía en la que el líquido (eluyente) sirve como fase móvil y es la fase estacionaria. absorbente, tv. un portador con un líquido o gel aplicado a su superficie. Se lleva a cabo en una columna rellena con un adsorbente (cromatografía en columna), en un plano ... ... Ciencias Naturales. diccionario enciclopédico

- [κρώμα (υroma) color] un proceso basado en la capacidad desigual de los componentes individuales de la mezcla (líquidos o gaseosos) para permanecer en la superficie del adsorbente tanto cuando son absorbidos de la corriente portadora como cuando... ... Enciclopedia geológica

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Cromatografía de términos Cromatografía de términos en inglés Sinónimos Abreviaturas Términos asociados cromatografía líquida de alta resolución, clatrato, laboratorio en un chip, porosimetría, proteoma, proteómica, sorbente, enzima, fullereno, endoédrico… … Diccionario Enciclopédico de Nanotecnología

Cromatografía líquida basada en descomp. la capacidad de los iones separados para intercambiar iones con los fijos. iones absorbentes formados como resultado de la disociación de los grupos ionogénicos de este último. Los intercambiadores de cationes se utilizan para separar cationes, para ... ... Enciclopedia química

HPLC- cromatografía líquida de alta resolución ... Diccionario de abreviaturas del idioma ruso

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es uno de los métodos efectivos para separar mezclas complejas de sustancias, que se usa ampliamente tanto en química analítica como en tecnología química. La base de la separación cromatográfica es la participación... Wikipedia

Libros

Práctica de cromatografía líquida de alta resolución, Veronica R. Mayer. Presentamos al lector la 5ª edición del libro, que se ha ampliado con métodos y equipos modernos. Se ha mejorado mucho en el libro y se ha añadido un gran número de referencias. Los lugares del texto donde...

(OFS 42-0096-09)

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un método de cromatografía en columna en el que la fase móvil (MP) es líquida

hueso que se mueve a través de una columna cromatográfica llena de

la fase visual (sorbente). Las columnas de HPLC se caracterizan por una alta presión hidráulica en la entrada de la columna, por lo que HPLC a veces se denomina

llamado "cromatografía líquida de alta presión".

Dependiendo del mecanismo de separación de sustancias, se distinguen los siguientes:

Opciones generales de HPLC: adsorción, distribución, intercambio iónico,

exclusivo, quiral, etc.

En la cromatografía de adsorción, la separación de sustancias ocurre debido a su diferente capacidad para ser adsorbidas y desorbidas con el aumento

superficie del adsorbente con una superficie desarrollada, por ejemplo, gel de sílice.

En HPLC de partición, la separación se produce debido a la diferencia en los coeficientes de distribución de las sustancias a separar entre las inmóviles

(generalmente injertado químicamente en la superficie de un soporte fijo) y

fases móviles.

Por polaridad, PF y NF HPLC se dividen en fase normal y ob-

rotación de fase.

La fase normal se llama una variante de la cromatografía, en la que

use un sorbente polar (por ejemplo, gel de sílice o gel de sílice con

NH2 trenzado - o CN-grupos) y PF no polar (por ejemplo, hexano con diferentes

suplementos personales). En la variante de fase reversa de la cromatografía,

utilizar sorbentes modificados químicamente no polares (por ejemplo,

radical alquilo no polar C18) y fases móviles polares (por ejemplo,

metanol, acetonitrilo).

En la cromatografía de intercambio iónico, las moléculas de las sustancias de la mezcla, disociación

en solución en cationes y aniones, se separan al pasar por

sorbente (intercambiador de cationes o intercambiador de aniones) debido a sus diferentes tasas de intercambio con iónico

mi grupos del sorbente.

En exclusión (tamiz, penetración en gel, filtración en gel)

Las moléculas de cromatografía de las sustancias se separan por tamaño debido a su diferente capacidad para penetrar en los poros de la fase estacionaria. Al mismo tiempo, el primero de

de las columnas salen las moléculas más grandes (de mayor peso molecular) que pueden penetrar en el mínimo número de poros de la fase estacionaria,

y las sustancias con tamaños moleculares pequeños salen en último lugar.

A menudo, la separación se produce no por uno, sino por varios mecanismos al mismo tiempo.

El método HPLC se puede utilizar para controlar la calidad de cualquier nega-

analitos similares. Para el análisis, se utilizan instrumentos apropiados: cromatógrafos líquidos.

La composición de un cromatógrafo de líquidos suele incluir los siguientes elementos básicos

nodos:

– Unidad de preparación de FP, incluido un contenedor con una fase móvil (o un contenedor

sti con solventes individuales que son parte de la fase móvil

zy) y sistema de desgasificación PF;

– sistema de bombeo;

– mezclador de fase móvil (si es necesario);

– sistema de inyección de muestra (inyector);

– columna cromatográfica (se puede instalar en un termostato);

– detector;

– sistema de recogida y tratamiento de datos.

Sistema de bombeo

Las bombas suministran el PF a la columna a una tasa constante dada. La composición de la fase móvil puede ser constante o variable.

durante el análisis. En el primer caso, el proceso se llama isocrático,

y en el segundo - gradiente. A veces instalado delante del sistema de bombeo

filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm para filtrar la fase móvil. Moderno

El sistema de bombeo variable de un cromatógrafo de líquidos consiste en una o más bombas controladas por una computadora. Esto le permite cambiar el

convirtiéndose en PF según un programa específico con elución en gradiente. Sme-

la mezcla de los componentes PF en el mezclador puede ocurrir tanto a baja presión

iones (antes de las bombas) y a alta presión (después de las bombas). El mezclador se puede utilizar para la preparación de PF y la elución isocrática,

sin embargo, se logra una proporción más precisa de los componentes con pruebas preliminares.

mezcla de componentes de PF para un proceso isocrático. Las bombas HPLC analíticas permiten mantener un caudal constante de PF en la columna en el rango de 0,1 a 10 ml/min a una presión de entrada de columna de hasta 50 MPa. Es aconsejable, sin embargo, que este valor no supere

chalo 20 MPa. Las pulsaciones de presión se minimizan mediante una amortiguación especial

Sistemas de casquillos incluidos en el diseño de bombas. Piezas de trabajo en-

Las bombas están hechas de materiales resistentes a la corrosión, lo que permite el uso de componentes agresivos en la composición del PF.

grifos

Por diseño, los mezcladores pueden ser estáticos o dinámicos.

micrófono

En el mezclador, se forma una única fase móvil a partir de

disolventes específicos suministrados por bombas, si la mezcla necesaria no se ha preparado con antelación. La mezcla de solventes generalmente ocurre espontáneamente, pero a veces se usan sistemas con mezcla forzada.

de coser.

inyectores

Los inyectores pueden ser universales para introducir muestras de

1 µl a 2 ml o discreto para inyección de muestra de solo un cierto volumen

ema. Ambos tipos de inyectores pueden ser automáticos ("auto-inyectores" o "auto-muestreadores"). El inyector para ingresar la muestra (solución) no se encuentra -

justo antes de la columna cromatográfica. El diseño del inyector permite cambiar la dirección del flujo de PF e introducir preliminarmente una muestra en un circuito de cierto volumen (generalmente de 10 a 100 μl).

Este volumen se indica en la etiqueta del bucle. El diseño del inyector permite la sustitución del bucle. Para introducir la solución analizada en no av-

inyector tomatic utiliza una microjeringa manual con un volumen significativamente

superando con creces el volumen del bucle. El exceso de la solución inyectada, no

en el loop se descarta y se inyecta en la columna el volumen exacto y siempre el mismo de muestra. El llenado manual incompleto del bucle reduce la precisión

precisión y reproducibilidad de la dosificación y, en consecuencia, degrada la precisión

y reproducibilidad del análisis cromatográfico.

columna de cromatografía

Las columnas cromatográficas suelen ser tubos de acero inoxidable, vidrio o plástico llenos de adsorbente y cerrados.

en ambos lados con filtros con un diámetro de poro de 2–5 µm. La duración de la analítica.

columna, dependiendo del mecanismo de separación cromatográfica, puede estar en el rango de 5 a 60 cm o más (usualmente es

10-25 cm), diámetro interior: de 2 a 10 mm (generalmente 4,6 mm). Las columnas con un diámetro interior de menos de 2 mm se utilizan en cromo de microcolumna

tografía También se utilizan columnas capilares con diámetros internos.

ron alrededor de 0,3-0,7 mm. Las columnas para cromatografía preparativa tienen un diámetro interno de hasta 50 mm o más.

Antes de la columna analítica, se pueden instalar cables cortos.

columnas (precolumnas) que realizan diversas funciones auxiliares

(más a menudo - protección de la columna analítica). Por lo general, el análisis se lleva a cabo en

a temperatura ambiente, sin embargo, para aumentar la eficiencia de separación y

acortando la duración del análisis, se puede utilizar un termostato

agotamiento de la columna a temperaturas que no excedan los 60 C. A temperaturas más altas, es posible la degradación del sorbente y un cambio en la composición del PF.

Fase estacionaria (sorbente)

Los adsorbentes comúnmente utilizados son:

1. El gel de sílice, la alúmina y el grafito poroso se utilizan en condiciones normales

cromatografía en fase pequeña. El mecanismo de retención en este caso

té - generalmente adsorción;

2. Resinas o polímeros con grupos ácidos o básicos. Alcance - cromatografía de intercambio iónico;

3. Gel de sílice poroso o polímeros (cromatografía de exclusión por tamaño);

4. Los adsorbentes modificados químicamente (adsorbentes con tejido injertado)

zami), preparado con mayor frecuencia a base de gel de sílice. El mecanismo de retención en la mayoría de los casos es la distribución entre móviles

noah y fases estacionarias;

5. Sorbentes quirales químicamente modificados, por ejemplo,

celulosas acuosas y amilosas, proteínas y péptidos, ciclodextrinas,

se utiliza para separar enantiómeros (cromatografía quiral)

Los adsorbentes de fase ligada pueden tener diversos grados de

modificación descarada. Las partículas absorbentes pueden ser esféricas o no esféricas.

forma regular y porosidad variada.

Las fases ligadas más utilizadas son:

– grupos octilo(sorbente octilsilano o C8);

– grupos octadecilo(sorbente octadecilsilano

(SAO) o C18);

– grupos fenilo(sorbente de fenilsilano);

– grupos cianopropilo(sorbente CN);

– grupos aminopropilo(adsorbente de NH2);

– grupos diol (diol sorbente).

Muy a menudo, el análisis se realiza en fases enlazadas no polares en

modo de fase inversa utilizando sorbente C18.

En algunos casos, es más apropiado utilizar normal

cromatografía de fase. En este caso, se utilizan gel de sílice o fases enlazadas polares ("CN", "NH2", "diol") en combinación con solutos no polares.

Los adsorbentes de fase ligada son químicamente estables a valores de pH de 2,0 a 8,0, a menos que el fabricante especifique lo contrario.

Las partículas absorbentes pueden tener una forma esférica o irregular y una variedad de porosidad. El tamaño de partícula del sorbente en la HPLC analítica suele ser de 3 a 10 µm, en la HPLC preparativa, hasta 50 µm o más.

También se utilizan adsorbentes monolíticos.

La alta eficiencia de separación es proporcionada por el área superficial alta de las partículas adsorbentes (que es una consecuencia de su microscopía).

la presencia de poros), así como la uniformidad de la composición del adsorbente y su empaquetamiento denso y uniforme.

detectores

Se utilizan varios métodos de detección. En el caso general, PF con componentes disueltos en él después de una columna cromatográfica

ki cae en la celda del detector, donde se mide continuamente una u otra de sus propiedades (absorción en la región UV o visible del espectro, fluorescencia,

índice de refracción, conductividad eléctrica, etc.). El cromatograma resultante es un gráfico de la dependencia de algunos

o parámetro físico-químico del PF a tiempo.

Los más comunes son los espectrofotométricos.

detectores (incluida la matriz de diodos), que registran un cambio en la óptica

densidad en el ultravioleta, visible y, a menudo, en el infrarrojo cercano

otras regiones del espectro de 190 a 800 o 900 nm. El cromatograma en este caso

té es la dependencia de la densidad óptica del PF en el tiempo.

El detector espectrofotométrico utilizado tradicionalmente permite

permite la detección en cualquier longitud de onda en su rango de operación

zona. También se utilizan detectores multionda, que permiten realizar

realizar la detección en varias longitudes de onda simultáneamente.

Con la ayuda de un detector de matriz de diodos, es posible no solo llevar a cabo la detección en varias longitudes de onda a la vez, sino también casi instantáneamente.

es posible (sin escanear) obtener el espectro óptico del PF en cualquier momento, lo que simplifica enormemente el análisis cualitativo de los componentes separados

componentes

La sensibilidad de los detectores fluorescentes es aproximadamente 1000 veces mayor que la de los espectrofotométricos. En este caso, se utiliza su propia fluorescencia o la fluorescencia de los derivados correspondientes si el analito en sí no emite fluorescencia. Moderno

Los detectores fluorescentes intercambiables hacen posible no sólo obtener cromato-

gramos, sino también para registrar los espectros de excitación y fluorescencia del análisis

conexiones viables.

Los detectores refractométricos se utilizan para analizar muestras que no absorben en las regiones UV y visible del espectro (por ejemplo, carbohidratos).

(refractómetros). Las desventajas de estos detectores son su baja sensibilidad (en comparación con los detectores espectrofotométricos) y una dependencia significativa de la temperatura de la intensidad de la señal (el detector debe estar termostatizado).

También se utilizan detectores electroquímicos (conductimétricos).

cielo, amperométrica, etc.), espectrometría de masas y Fourier-IR

detectores, detectores de dispersión de luz, radiactividad y algunos otros

fase móvil

V Una variedad de solventes, tanto individuales como sus mezclas, pueden usarse como PF.

V fase normal La cromatografía suele utilizar carbón líquido.

hidrocarburos (hexano, ciclohexano, heptano) y otros relativamente no polares

disolventes con pequeñas adiciones de compuestos orgánicos polares,

que regulan la fuerza de elución del PF.

En la cromatografía de fase reversa, la composición del PF incluye polar or-

disolventes orgánicos (normalmente acetonitrilo y metanol) y agua. para opti-

Los estudios de separación a menudo usan soluciones acuosas con un cierto signo

Valor de pH, en particular soluciones tampón. Se utilizan aditivos inorgánicos.

ácidos cálicos y orgánicos, bases y sales y otros compuestos (sobre

ejemplo, modificadores quirales para separar enantiómeros en aquiral-

nom sorbente).

El control del valor de pH debe realizarse por separado para el componente acuoso, y no para su mezcla con un disolvente orgánico.

PF puede consistir en un solvente, a menudo dos, si es necesario

dimity - de tres o más. La composición de PF se indica como la relación de volumen de sus disolventes constituyentes. En algunos casos, la masa

proporción, que deberá ser estipulada especialmente.

Cuando se utiliza un detector espectrofotométrico UV, el PF no debe tener una absorción pronunciada en la longitud de onda elegida para la detección. El límite de transparencia o densidad óptica al determinar

la longitud de onda especificada del solvente de un fabricante en particular a menudo se indica

está en el paquete.

El análisis cromatográfico está muy influenciado por el grado de pureza del PF, por lo que es preferible utilizar disolventes producidos

nye específicamente para cromatografía líquida (incluyendo agua).

El PF y las soluciones analizadas no deben contener

partículas y burbujas de gas. Agua obtenida en el laboratorio

soluciones acuosas premezcladas con agua disolventes orgánicos

Los disolventes, así como las soluciones analizadas, deben someterse a filtración fina y desgasificación. El filtrado se suele utilizar para este propósito.

al vacío a través de un filtro de membrana inerte con respecto a este disolvente o solución con un tamaño de poro de 0,45 μm.

Sistema de recopilación y procesamiento de datos.

Un sistema moderno de procesamiento de datos es un sistema conjugado

computadora personal conectada con el cromatógrafo con software instalado

software que le permite registrar y procesar crono-

matograma, así como administrar el funcionamiento del cromatógrafo y monitorear los principales

mi parámetros del sistema cromatográfico.

Lista de condiciones cromatográficas a especificar

En una monografía privada, las dimensiones de la co-

columnas, tipo de sorbente con indicación del tamaño de partícula, temperatura de la columna (si es necesario controlar la temperatura), volumen de muestra inyectada (volumen del circuito),

Estado de PF y método de preparación, tasa de alimentación de PF, detector y condiciones de detección, descripción del modo de gradiente (si se usa), tiempo de cromatografía.

INTERCAMBIO IÓNICO Y HPLC IÓNICO

La cromatografía de intercambio iónico se utiliza para el análisis como un orgánico

skikh (bases heterocíclicas, aminoácidos, proteínas, etc.), y no o

compuestos gánicos (varios cationes y aniones). Separación de componentes

componentes de la mezcla analizada en cromatografía de intercambio iónico se basa en la interacción reversible de los iones de las sustancias analizadas con grupos iónicos.

sorbente pami. Los intercambiadores de aniones o intercambiadores de cationes se utilizan como adsorbentes.

Uds. Estos adsorbentes son principalmente ion-poliméricos

resinas de intercambio (generalmente copolímeros de estireno y divinilbenceno con injerto

grupos iónicos), o geles de sílice con grupos de intercambio iónico injertados. Los adsorbentes con grupos -(CH2)3 N+ X– se utilizan para separar aniones, y los adsorbentes con grupos -(CH2)SO3 – H+ se utilizan para separar cationes.

Por lo general, las resinas poliméricas se utilizan para separar aniones y para separar e-

Los cationes son geles de sílice modificados.

Como PF en la cromatografía de intercambio iónico, se utilizan soluciones acuosas de ácidos, bases y sales. Normalmente se utilizan carreras de búfer

soluciones que le permiten mantener ciertos valores de pH. También es posible utilizar pequeños aditivos orgánicos miscibles en agua.

solventes cal - acetonitrilo, metanol, etanol, tetrahidrofurano.

cromatografía iónica- una variante de la cromatografía de intercambio iónico, en

que, para determinar la concentración de iones del analito, se utiliza

utilizando un detector conductimétrico. Para operaciones altamente sensibles

Para determinar los cambios en la conductividad eléctrica que pasa por el detector de FP, la conductividad eléctrica de fondo del FP debe ser baja.

Hay dos variantes principales de la cromatografía iónica.

El primero de ellos se basa en la supresión de la conductividad eléctrica del electrolítico.

ese PF usando la segunda columna de intercambio iónico ubicada entre el anal-

columna lítica y detector. En esta columna tiene lugar la neutralización.

PF y los compuestos analizados ingresan a la celda detectora en desionización

agua zirovannoy. Los iones detectados son los únicos iones

asegurando la conductividad del PF. La desventaja de la columna supresora es la necesidad de su regeneración a intervalos bastante cortos.

yo. La columna de supresión se puede sustituir por una columna de funcionamiento continuo

supresor de membrana, en el que la composición de la membrana es continuamente

es el flujo de solución regeneradora moviéndose en la dirección

opuesta a la dirección del flujo de PF.

La segunda versión de la cromatografía iónica es la cromatografía iónica de columna única.

matografía En esta variante se utiliza un PF de muy baja conductividad eléctrica.

contenido de agua. Los compuestos orgánicos débiles son ampliamente utilizados como electrolitos.

ácidos del cielo - benzoico, salicílico o isoftálico.

TAMAÑO HPLC

La cromatografía de exclusión por tamaño (cromatografía en gel) es una versión especial de HPLC basada en la separación de moléculas según su tamaño. Distribución

moléculas entre las fases estacionaria y móvil se basa en el tamaño del mo-

moléculas y en parte de su forma y polaridad. Para la separación, utilice

absorbentes porosos: polímeros, gel de sílice, vidrios porosos y polisacáridos.

El tamaño de partícula de los adsorbentes es de 5 a 10 µm.

Las ventajas de los vidrios porosos y el gel de sílice son la rápida difusión de PF y las moléculas de analito en los poros, la estabilidad en diversas condiciones (incluso a altas temperaturas). Sorbeno polimérico

son copolímeros de estireno y divinilbenceno (este es un hidro-

absorbentes fóbicos utilizados con fases móviles no polares) y

geles hidrófilos obtenidos a partir de resinas de poliacrilamida o divinilbenceno sulfonadas.

Son posibles dos tipos limitantes de interacción de moléculas con una fase estacionaria porosa. Las moléculas más grandes que el diámetro medio de un poro no penetran en absoluto en el adsorbente y se eluyen junto con la fase móvil.

zoy primero. Moléculas con un diámetro mucho más pequeño que el tamaño de poro del tipo

las curvas penetran libremente en él, permanecen en la fase estacionaria durante más tiempo y se eluyen en último lugar. Moléculas de tamaño mediano penetran en los poros del adsorbente dependiendo de su tamaño y parcialmente dependiendo de su forma. Eluyen con diferentes tiempos de retención entre

nuestras moléculas más grandes y más pequeñas. La separación de los componentes de la muestra cromatográfica se produce como resultado de ac-

la difusión de los componentes de la muestra en los poros del sorbente, y viceversa.

En la cromatografía de exclusión por tamaño, para caracterizar la retención,

se utiliza un volumen de retención igual al producto del caudal de PF y el tiempo de retención.

fase móvil. La elección del PF depende del tipo de adsorbente. Exclusión-

la cromatografía generalmente se divide en filtración en gel y cromatografía en gel.

cromatografía de permeación.

El método de cromatografía de filtración en gel se utiliza para separar

de compuestos solubles en agua sobre adsorbentes hidrofílicos. Las fases móviles son soluciones tampón acuosas con un valor de pH determinado.

La cromatografía de permeación en gel utiliza hidrofóbico

compuestos y disolventes orgánicos no polares (tolueno, diclorometano, tetra-

hidrofurano). Este método se utiliza para analizar compuestos que son ligeramente solubles.

bordeado en agua.

detectores Como detectores en la cromatografía de exclusión por tamaño, se utilizan detectores refractométricos diferenciales, así como detectores espectrofotométricos (incluidos los de la región IR del espectro).

También se utilizan detectores láser viscométricos y de flujo.

Estos detectores, en combinación con un refractómetro u otra concentración

detector le permite determinar continuamente el peso molecular de

limador en PF.

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ULTRA RENDIMIENTO

La cromatografía líquida de ultra rendimiento es una variante de la cromatografía líquida que es más eficiente

stu en comparación con HPLC clásica.

Una característica de la cromatografía líquida de ultra rendimiento es

el uso de adsorbentes con un tamaño de partícula de 1,5 a 2 micras. Cro-

columnas matográficas son por lo general de 50 a 150 mm de longitud y 1

hasta 4 mm de diámetro. El volumen de la muestra inyectada puede ser de 1 a 50 µl.

Equipo cromatográfico utilizado en la clásica.